Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка трубки, электрода и инструментов для хирургической процедуры
- Используйте следующие микрохирургические инструменты: хирургические ножницы, угловые микроножницы, тканевые щипцы, пару изогнутых микрощипцов Dumont #7 и #5, микроиглодержатель и ретракторы.
заметка: Это острая процедура, поэтому инструменты не нужно стерилизовать. После использования очистите и протрите кончики 70% этанолом.
- Замочите трубку в 70% этаноле, а затем промойте ее стерильным 0,9% NaCl со 100 Ед/мл гепарина перед использованием. Оставьте трубку заполненной, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в систему.
- Отрежьте кусок трубки из полиэтилена (ПЭ)-50 длиной 20-30 см, чтобы сделать катетер для измерения внутрикавернозного давления (ВЧД). Убедитесь, что трубка как можно короче, чтобы уменьшить демпфирование давления.
- Согните стерильную иглу 24G из стороны в сторону, пока игла не сломается посередине. Соедините деталь со скосом с дистальным концом полиэтиленовой трубки для введения в голень полового члена. Вставьте вторую половинку в ступицу для подключения к датчику давления. Заполните систему гепаринизированным физиологическим раствором (100 ЕД/мл).
- Чтобы изготовить биполярный электрод с тефлоновым покрытием, отрежьте две серебряные проволоки длиной 125 мкм одинаковой длины. С помощью куска ленты прикрепите провода к краю стола и продейте их вместе. Затем прикрепите электрод к черной пластине.
- Сделайте небольшой надрез в тефлоне и с помощью микрощипцов #5 снимите тефлоновое покрытие длиной 4-5 мм с кончиков электродов. Отрежьте кончики скальпелем, чтобы добиться одинаковой длины, и создавайте крючки, загибая концы вокруг тупого края лезвия скальпеля.
- Обмотайте электрод лентой концом, слегка выступающим за край черной пластины крючками, направленными вверх. Смешайте силиконовый клей на пластиковой пластине в течение 10 с и оберните клеевой пузырь вокруг электрода в 1-2 мм от крючка.
- Дайте ему высохнуть в течение примерно 5 минут перед использованием (Рисунок 1). Снимите тефлон с более длинной секции на другом конце, чтобы обеспечить подключение к стимулятору.
заметка: При повторном наложении крючков на дистальном конце электрод может быть использован многократно.
2. Подготовка животного
- После обезболивания животного побрейте нижнюю половину живота, шею и промежность. Потрите животное 70% спиртом с последующим добавлением повидон-йода три раза. Положите крысу на подогретую хирургическую прокладку в лежачем положении на спине. Нанесите ветеринарную глазную мазь и переключите анестезию на носовой конус с 2,5% изофлураном и 0,8 л/мин кислорода в качестве носителя.
заметка: Отрегулируйте уровень изофлурана и кислорода для достижения приемлемого уровня анестезии.
3. Предоперационная подготовка
- Выполняйте всю хирургическую процедуру под операционным микроскопом: достаточно увеличения в диапазоне от 3,15X до 20X. Используйте перчатки и поддерживайте чистоту на протяжении всей операции. Поместите крысу на простыню.
4. Диссекция ишиокавернозной мышцы для измерения ВЧД
- С помощью скальпеля, прямых ножниц и изогнутых микрощипцов Dumont #7 сделайте вертикальный разрез кожи размером 1 см на 5 мм латеральнее средней линии, начиная с уровня основания полового члена и продолжаясь вниз (Рисунок 2A). Используйте ватную палочку и осторожно отделите фасцию латерально к мошонке (рисунок 2B). После рассечения фасции прикрепите ретракторы и пальпируйте с помощью ватного наконечника, чтобы найти седалищный бугр (рис. 2C).
- Рассекайте через жировую ткань медиально от этой точки до тех пор, пока не будет визуализирована седалищная мышца (рисунок 3А). Используйте пару изогнутых микрощипцов Dumont #7 и разделите мышцу в продольном направлении. Белочная оболочка будет выглядеть как ярко-белая структура (Рисунок 3B). С помощью микрощипцов и микроножниц обнажите белочную оболочку в достаточной степени, чтобы увидеть ее ход (Рисунок 3C).
- После калибровки настроек системы вставьте трубку через кожу в промежность, убедившись, что она проходит параллельно голени полового члена (рис. 4). Оставьте линию на месте и поддерживайте разрез влажным с помощью физраствора.
5. Диссекция КН для стимуляции
- Сделайте разрез живота на 2 см ниже, по средней линии живота, сначала с помощью скальпеля, а затем прямых ножниц и микрощипцов. Сделайте соответствующий разрез через фасцию вдоль белой линии и подлежащей мышечной ткани, чтобы обнажить мочевой пузырь и простату.
- Используйте втягивающие устройства для достижения хорошей экспозиции. Используйте ватные тампоны для отделения простаты от жировой ткани, чтобы получить четкую визуализацию большого тазового ганглия (MPG) и кавернозного нерва (CN), проходящего на дорсолатеральной стороне простаты (Рисунок 5).
- После визуализации МПГ и КН осторожно разрежьте фасцию, расположенную над нервом на расстоянии 2-5 мм дистальнее МПГ, угловыми микроножницами (рис. 6а). С помощью микрощипцов #5 распределите ткань по каждой стороне нерва и под ним, чтобы освободить участок длиной 4 мм (Рисунок 6b), и проложите шов 9-0 под нерв (Рисунок 6c).
- Слегка приподнимите нерв с помощью шовной нити (Рисунок 7a), чтобы облегчить размещение крючков биполярного электрода вокруг нерва (Рисунок 7b). Дайте помощнику перемешать двухкомпонентный силиконовый клей кончиком инсулиновой иглы в течение 5 с. Высушите нерв и нанесите клей на область вокруг крючков и нерва (рисунок 7c, d). Держите нерв в приподнятом положении, слегка потянув за электрод примерно на 1 минуту, чтобы клей высох.
- Снимите втягивающие устройства, за исключением втягивающих устройств с правой стороны, во избежание вытягивания или скручивания электрода. Смочите обнаженные органы физиологическим раствором и положите на разрез марлю, смоченную в физрастворе.
6. Канюляция кавернозного тела для измерения ВЧД
- Восстановите визуализацию белочной оболочки с помощью ретракторов. Следите за тем, чтобы не прикреплять ретракторы к седалищной мышце, так как это приведет к деформации голени.
- Прикрепите иглу и промойте трубку гепаринизированным физиологическим раствором, прежде чем вводить его в белочную оболочку. Держите белочную оболочку в растянутом положении, используя изогнутые микрощипцы Dumont #7 в одной руке (не доминантные), удерживая белочную оболочку и остальную часть вышележащей мышцы дистальнее точки введения. Держите иглу прямыми микрощипцами в другой доминирующей руке и введите ее параллельно ходу кавернозного тела (Рисунок 8).
- Вдавите иглу на 5-8 мм в пещеристое тело. Промойте трубку и нажмите на горлышко, чтобы проверить линию (Рисунок 9). Убедитесь в отсутствии утечек. Закрепите трубку на столе с помощью ленты, чтобы предотвратить случайное натягивание лески. Снимите втягивающие устройства.
7. Стимуляция ЧН
- При запуске программы записи (например, Spike 2) непрерывно записывайте внутрикавернозное и среднее артериальное давление.
- Установите следующие параметры на стимуляторе (например, SD9 Grass Instruments, см. Таблицу материалов) для стимуляции ЦН: ток на 1,5 мА, частота на 16 Гц, напряжение на 3 В и ширина импульса на 5 мс. Примените 50 с стимуляции с минимальным отдыхом 1 минута между стимуляциями.
заметка: Первые стимулы обычно приводят к снижению реакции (Рисунок 10).
