Запись цельноклеточного патч-зажима в нейроне желатиновой субстанции среза спинного мозга

Аннотация

Источник: Zhu, M., et al. Приготовление острых срезов спинного мозга для записи целых клеток в нейронах субстанции желатиноза. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует процедуру выполнения электрофизиологических записей в нейронах студенческой субстанции (SG) срезов спинного мозга с использованием методов патч-clamp цельных клеток для анализа паттернов возбуждения нейронов. Этот метод позволяет изучать нейронные реакции на раздражители в SG-нейронах спинного мозга.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующей экспертизой по этике животных.

1. Приготовление растворов и материалов

1. Решения
   1. Приготовить искусственную спинномозговую жидкость (АКЦФ) (в мМ): 117 натрия хлорида (NaCl), 3,6 калия хлорида (KCl), 1,2 натрия дигидрофосфата дигидрата (₂PO₄·2H₂O), 2,5 кальция хлорида дигидрата (CaCl₂·2H₂O), 1,2 магния хлорида гексагидрата (MgCl₂·6H₂O), 25 натрия бикарбоната (NaHCO₃), 11 D-глюкозы, 0,4 аскорбиновой кислоты, и 2 пирувата натрия. Смотрите таблицу 1.
   2. Готовят внутриклеточный раствор на основе К⁺ (в мМ): 130 К-глюконата, 5 KCl, 10 Na 2-фосфокреатина, 0,5 этиленгликоля-бис(β-аминоэтилового эфира)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA), 10 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES), 4 аденозинтрифосфата магния (Mg-ATP) и 0,3 гуанозинтрифосфата лития (Li-GTP). Смотрите таблицу 2.
   3. Приготовьте внутриклеточный раствор на основе цезия (Cs⁺) (в мМ): 92 сульфоната метана цезия (CsMeSO₄), 43 хлорида цезия (CsCl), 10 Na 2-фосфокреатина, 5 тетраэтиламмония (TEA)-Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-АТФ и 0,3 Li-GTP. Смотрите таблицу 3.
      заметка: Все растворы должны быть приготовлены с использованием дистиллированной воды. ACSF и сахароза-ACSF должны быть карбогенированы (смесь 95%_O2 и 5% CO₂) перед применением для поддержания оптимального pH примерно 7,4, а осмоляльность этих двух растворов должна быть скорректирована до 300–310 миллиосмолей (мОсм). Поскольку аскорбиновая кислота может влиять на кальциевые каналы, этот агент следует исключить, если вы хотите зарегистрировать кальциевые токи. Осмоляльность и рН внутриклеточных растворов должны быть измерены и скорректированы до 290–300 мОсм и 7,2–7,3 соответственно. Внутриклеточные растворы рекомендуется фильтровать с помощью фильтров 0,2 мкм и хранить растворы в виде аликвот по 1 мл при -20 °С. Cs⁺ и TEA применяются во внутриклеточном растворе на основе Cs⁺ для блокирования калиевого канала, что способствует использованию усилителя для удержания мембранного потенциала стабильным на уровне 0 мВ при регистрации тормозных постсинаптических токов (IPSC).
2. Инструменты
   1. Для типичной электрофизиологической системы используйте вертикальный микроскоп с инфракрасным дифференциальным интерференционным контрастом (IR-DIC) и погружным объективом высокого разрешения, камеру CCD/CMOS, усилитель с патч-зажимом, держатель микропипетки и микроманипулятор, позволяющий точно регулировать положение пипетки. Для перемещения микроскопа также необходим двухкоординатный столик.
   2. Установите все оборудование на виброизоляционный стол, окруженный клеткой Фарадея. Подключите видеомонитор к видеокамере, чтобы наблюдать за нейронами и визуализировать микропипетки.
3. Микропипетки
   1. Сделайте записывающие электроды из капилляров из боросиликатного стекла с помощью съемника микропипетки. Типичное сопротивление пипетки колеблется в пределах 3-6 МОм при заполнении внутриклеточным раствором.

2. Запись с помощью патч-клэмпа целой ячейки

1. Для проведения полноклеточной записи патч-зажима с нейронов субстанции желатинозы (SG) в большинстве случаев используют внутриклеточный раствор на основе К⁺, а для регистрации тормозных постсинаптических токов – только раствор на основе Cs⁺.
2. Аккуратно переместите срез спинного мозга в записывающую камеру, а затем прочно закрепите его U-образной платиновой проволокой, прикрепленной нейлоновыми нитями, для оптимальной стабильности среза. Постепенно перфузируйте ломтик пузырьковым ACSF при RT через гравитационную систему и установите скорость перфузии на уровне 2–4 мл/мин для достижения достаточного насыщения кислородом.
3. Определите область SG (полупрозрачной полосы) с помощью линзы микроскопа с низким разрешением, выберите здоровый нейрон, используя объектив высокого разрешения в качестве целевой клетки, и отрегулируйте его по центру экрана видеомонитора.
4. При необходимости наполните микропипетку соответствующим объемом внутриклеточного раствора на основе K⁺ или Cs⁺, вставьте микропипетку в держатель электродов и убедитесь, что внутриклеточный раствор контактирует с серебряной проволокой внутри держателя.
5. Сфокусируйте микропипетку, погрузите ее в ACSF с помощью микроманипулятора, а затем приложите умеренное положительное давление (~1 фунт на квадратный дюйм при измерении с помощью манометра), чтобы оторвать микропипетку от грязи и мусора.
6. Постепенно перемещайте микропипетку по направлению к целевому нейрону. Сбросьте положительное давление, как только пипетка приблизится к нейрону, и на мембране нейрона образуется очень маленькая ямочка, образующая гигауплотнение.
7. Измените удерживающий потенциал до -70 мВ, что близко к физиологическому мембранному потенциалу покоя (RMP) клетки. Затем примените временное и мягкое отсасывание к микропипетке, чтобы разорвать мембрану и создать хорошую конфигурацию всей клетки.
   заметка: После переноса среза в записывающую камеру обеспечьте устойчивую перфузию в течение не менее 5 минут, чтобы очистить поверхность среза от мусора. Стоит отметить, что способность различать здоровые и нездоровые/мертвые нейроны имеет первостепенное значение для хорошей герметизации и стабильной записи. Нездоровый/мертвый нейрон имеет опухший или сморщенный вид вместе с видимым большим ядром, в то время как здоровый нейрон характеризуется трехмерной (3D) формой с яркой и гладкой мембраной, а его ядро невидимо. Чтобы получить конфигурацию со всей ячейкой, важно при необходимости шаг за шагом компенсировать быструю или медленную емкость. При комнатной температуре (RT) потенциал жидкостного перехода рассчитывается как 15,1–15,2 мВ (мВ) и 4,3–4,4 мВ во внутриклеточных решениях на основе K⁺ и Cs⁺ соответственно. В наших исследованиях зарегистрированные данные не были скорректированы на потенциал жидкостного перехода.
8. Регистрация свойств собственной мембраны
   1. Запишите свойства возбуждения: Проверьте характер возбуждения каждого нейрона в токовом зажиме с серией импульсов деполяризующего тока длительностью 1 с (25–150 пикоампер (пА) с шагом 25 пА) при RMP. Измерьте порог, амплитуду и половинную ширину потенциала одиночного действия в автономном режиме.

Таблица 1: Рецепт ACSF

мм См. мм См. См. См. См. мм Сталь

компонент	Молекулярная масса	Концентрация (мМ)	г/л
NaCl	58,5	117	6.84
KCl	74,5	3.6	0,27
NaH2PO4·2H2O	156	1.2	0,19
CaCl2·2H2O	147	2.5	0,37
MgCl2·6H2O	203	1.2	0,24
NaHCO3	84	25	2.1
D-глюкоза	180	11	1,98
аскорбиновая кислота	198,11	0,4	0,08
Пируват натрия	110	2	0.22

Таблица 2: Рецепт внутриклеточного раствора на основе K⁺

См. Кабель мм См. Кабель Кабель мм См. Сталь См. Сталь см. Кабель мм

компонент	Молекулярная масса	Концентрация (мМ)	мг/100 мл
К-глюконат	234,2	130	3044.6
KCl	74,5	5	37.28
Na2-фосфокреатин	453.38	10	453.38
ЭГТА	380,35	0,5	19.02
ХЕПЕС	238,31	10	238.3
Мг-АТФ	507,18	4	202,9
Li-GTP	523.18	0,3	15,7

Таблица 3: Рецепт внутриклеточного решения на основе Cs⁺

Сталь Сталь Кабель Кабель Тариф мм См. Сталь См. Сталь см. Кабель мм

компонент	Молекулярная масса	Концентрация (мМ)	мг/100 мл
CsMeSO4	228	92	No 2097.6
CsCl	168,36	43	723,95
Na2-фосфокреатин	453.38	10	453.38
ТЕА-Кл	165,71	5	82,86
ЭГТА	380,35	0,5	19.02
ХЕПЕС	238,31	10	238.3
Мг-АТФ	507,18	4	202,9
Li-GTP	523.18	0,3	15,7

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
NaCl	сигма	С7653	Используется для приготовления ACSF и PBS
KCl	сигма	Номер 60130	Используется для приготовления внутриклеточного раствора на основе сахарозы-ACSF и К+
NaH2PO4·2H2O	сигма	71500	Используется для приготовления ACSF, сахарозы - ACSF и PBS
CaCl2·2H2O	сигма	С5080	Используется для приготовления ACSF и сахарозы - ACSF
MgCl2·6H2O	сигма	М2670	Используется для приготовления ACSF и сахарозы - ACSF
NaHCO3	сигма	С5761	Используется для приготовления ACSF и сахарозы - ACSF
D-глюкоза	сигма	Г7021	Используется для приготовления ACSF
аскорбиновая кислота	сигма	П5280	Используется для приготовления ACSF и сахарозы - ACSF
Пируват натрия	сигма	А7631	Используется для приготовления ACSF и сахарозы - ACSF
сахароза	сигма	С7903	Используется для приготовления сахарозы-ACSF
К-глюконат	Вако	169-11835	Используется для приготовления внутриклеточного раствора на основе К+
Na2-фосфокреатин	сигма	С1937	Используется для приготовления внутриклеточного раствора
ЭГТА	сигма	Е3889	Используется для приготовления внутриклеточного раствора
ХЕПЕС	сигма	Н4034	Используется для приготовления внутриклеточного раствора
Мг-АТФ	сигма	А9187	Используется для приготовления внутриклеточного раствора
Li-GTP	сигма	Г5884	Используется для приготовления внутриклеточного раствора
CsMeSO4	сигма	С1426	Используется для приготовления внутриклеточного раствора на основе Cs+
CsCl	сигма	С3011	Используется для приготовления внутриклеточного раствора на основе Cs+
ТЕА-Кл	сигма	Т2265	Используется для приготовления внутриклеточного раствора на основе Cs+
На2НПО4	Химические реактивы Hengxing		Используется для приготовления ПБС
Капилляры из боросиликатного стекла	Мировые прецизионные приборы	ТВ150Ф-4	Внешний диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 1,12 мм
Съемник микропипеток	Инструмент Саттера	-97	Используется для приготовления микропипеток
Инфракрасная ПЗС-камера	Дейдж-Массачусетский технологический институт	ИК-1000
Усилитель с патч-зажимом	ХЕКА	ЭПС-10
микроманипулятор	Инструмент Саттера	МП-285
Ступень X-Y	Берли	GIBRALTAR X-Y
Вертикальный микроскоп	Олимп	BX51WI
Осмометр	продвинутый	ФИСКЕ 210
Измеритель pH	Mettler Toledo	ФЭ20

гг.