Регистрация электрической активности мозга у мышей с помощью многокорпусных линейных кремниевых зондов

Аннотация

Источник: Sauer, J., et al. Запись пространственно ограниченных колебаний в гиппокампе ведущих себя мышей. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео описывается протокол имплантации многостоечного линейного силиконового зонда в мозг мыши для измерения локальных полевых потенциалов. Процедура включает в себя прикрепление зонда к стереотаксической единице, его точное позиционирование над целевой областью мозга, введение его в мозг и закрепление стоматологическим цементом. После имплантации сборка защищена кожухом. После восстановления установка позволяет регистрировать потенциалы локальных полей, что дает представление об активности нейронов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка

1. Спроектируйте и изготовьте подходящий инструмент для введения, который будет постоянно переносить силиконовый зонд и соединитель электрода в процессе имплантации. На рисунке 1 приведен пример специально созданного инструмента вставки.
2. Осторожно извлеките силиконовый щуп и соединитель электрода из упаковки с помощью щипцов с керамическими наконечниками.
3. Поднимите соединительную плату и надежно зафиксируйте ее с помощью зажима типа «крокодил», прикрепленного к подставке.
4. С помощью стереоскопа совместите зонд с инструментом для введения щипцами с керамическими наконечниками. Нанесите слой парафина толщиной ~2 мм, расплавленного с помощью прижигания, чтобы приклеить щуп к инструменту для введения. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться к хвостовику щупа во время этой процедуры.
5. Закрепите электродный соединитель на валу инструмента для вставки с помощью стандартной скотчевой ленты. Обратите внимание, что в зависимости от производителя перед имплантацией может потребоваться припаять провода заземления к плате электродного разъема. Снимите изоляцию с двух коротких отрезков медного провода с лаковой изоляцией с помощью оловянного припоя, нанесенного паяльником (400 °C). Припаяйте провода заземления к соответствующим пазам в плате электродного разъема.
6. Снимите изоляцию с двух дополнительных кусков медного провода. Оберните каждый оголенный медный провод три раза вокруг винта из нержавеющей стали (диаметр 1 мм, длина 2 мм). Нанесите подходящий для пайки стали флюс и припаяйте медную проволоку к нижней части винтовой крышки. Следите за тем, чтобы нижняя половина резьбы винта оставалась свободной от оловянного припоя.
7. Используйте стандартный мультиметр для проверки электрического контакта между проводом и винтом.
8. Продезинфицируйте хвостовики силиконового щупа и винты заземления, погрузив их в 70% этанол (10 с).
9. Подготовьте защитный чехол для имплантата зонда, разрезав головку пластиковой пастеровской пипетки пополам.

2. Хирургия имплантации

1. Хирургические инструменты (ножницы, щипцы с тонким наконечником, хирургические зажимы) стерилизуйте с помощью стерилизатора с горячими шариками. Протрите все поверхности 70% этанолом.
2. Индуцируйте анестезию 3% изофлураном в кислороде, доставляемым со скоростью ~1 л/мин.
   1. Для поддержания используют 1 - 1,5% изофлуран. Обратите внимание, что концентрация изофлурана, необходимая для достижения хирургической толерантности, может варьироваться от животного к животному.
   2. Стабильная хирургическая переносимость достигается в том случае, когда животное не реагирует на защемление пальцев ног. Следите за частотой дыхания мыши и при необходимости корректируйте концентрацию изофлурана.
   3. Нанесите мазь на глаза животного, чтобы не допустить пересыхания.
3. Закрепите мышь в стереотаксической раме, аккуратно вставив ушные планки в ушной канал. После того, как голова мыши стабилизируется ушными планками, поместите мундштук на морду для непрерывной доставки изофлурана. Положите мышь на полотенце или салфетку поверх грелки и введите бупренорфин подкожно (0,05 - 0,1 мг/кг массы тела) для обеспечения послеоперационной анальгезии.
4. Побрейте голову стандартной бритвой и продезинфицируйте кожу 70% этанолом. С помощью хирургических ножниц сделайте разрез в коже по средней линии черепа и вскройте кожу с помощью хирургических зажимов.
5. Выровняйте голову животного с помощью стереотаксического инструмента выравнивания, чтобы выровнять брегму и лямбду. Смещение высоты между брегмой и лямбдой должно составлять менее 50 мкм. Кроме того, выровняйте голову вдоль медиолатеральной оси, измерив глубину от брегмы на поверхности черепа на определенных расстояниях слева и справа (например, на 1 мм слева и справа от брегмы). При необходимости отрегулируйте наклон головы.
6. Очистите голову 3% перекисью водорода и вытрите насухо стерильными ватными салфетками.
7. Определите расположение трепанации черепа относительно брегмы с помощью соответствующего стереотаксического атласа.
8. С помощью сверлильной головки диаметром 0,9 мм просверлите два отверстия для винтов в кости над мозжечком, чтобы разместить заземленные и опорные винты. Дополнительно желательно 1 – 3 отверстия для анкерных винтов для стабилизации имплантата. Расположение анкерных винтов будет зависеть от места проведения трепанации черепа. Для имплантации в гиппокамп установите анкерные винты над контралатеральной теменной и ипсилатеральной лобной корой. Вставьте винты в кость с помощью подходящей отвертки. Следите за тем, чтобы не проникнуть в мозг.
9. Выполняйте трепанацию черепа, медленно истончая череп с помощью сверла в прямоугольной области вокруг имплантационной стороны. Часто смачивайте кость стерилизованным фосфатным буфером (ПБ). Оставшийся истонченный череп можно аккуратно проколоть и удалить с помощью тонкой (27G) инъекционной иглы и пинцета.
10. Осторожно проткните твердую мозговую оболочку тонкой (27G) инъекционной иглой. Сформируйте небольшой крючок, согнув кончик иглы пинцетом, и потяните за твердую мозговую оболочку для удаления. Наносите PB, чтобы предотвратить высыхание поверхности мозга.
11. Установите инструмент для введения электродов на стереотаксический держатель, обнулите зонд на брегме и переместите зонд в стереотаксические координаты над краниотомией. Медленно проникают на поверхность мозга. Следите за тем, чтобы валы щупов не перегибались. Избегайте имплантации через кровеносные сосуды.
12. Медленно опустите зонд до ~200 мкм над желаемой глубиной. Покройте краниотомию и хвостовики силиконового зонда стерилизованным вазелином для защиты. Нанесите стоматологический цемент для фиксации основания зонда к анкерному винту в черепе.
13. Сразу после нанесения цемента медленно переместите зонд на заданную глубину. Продвижение на последние ~200 мкм после нанесения цемента уменьшает боковое смещение зонда и обеспечивает минимальное повреждение тканей в целевой области. Обратите внимание, что время отверждения используемого цемента может повлиять на этот этап протокола. При быстроотверждаемом цементе пропустите этот этап и имплантируйте зонд непосредственно на целевую глубину, чтобы избежать повреждения силиконового зонда.
14. После того как цемент застынет, освободите зонд от инструмента для введения, расплавив воск с помощью прижигателя.
15. Освободите соединительную плату от устройства для введения и расположите ее в подходящем месте на черепе с помощью зажима типа «крокодил», прикрепленного к рукоятке введения. В случае имплантации зонда в гиппокамп поместите соединительную плату на контралатеральную теменную кость. Закрепите соединительную плату на черепе с помощью стоматологического цемента.
16. Припаяйте заземляющий и опорный провода соединительной платы к проводам, прикрепленным к двум винтам над мозжечком.
17. Подрежьте защитную крышку на нужную высоту и поместите ее над силиконовым щупом. Закрепите крышку на соединительной плате и черепе с помощью стоматологического цемента, избегая кожи вокруг открытого черепа. Наложение швов на кожу вокруг места имплантации обычно не требуется.

3. Восстановление после операции

1. Применяйте соответствующее обезболивающее лечение в течение не менее 2 дней (например, подкожные инъекции бупренорфина каждые 6 ч в дневное время и в питьевую воду на ночь в сочетании с карпрофеном (4 - 5 мг/кг массы тела) подкожно каждые 24 ч). Для предотвращения повреждения имплантата рекомендуется использовать одноместный корпус.
2. Подождите не менее одной недели для восстановления. Ознакомьтесь с местными рекомендациями по защите животных.

4. Сбор данных

1. Записывайте LFP от свободно движущихся мышей с помощью подходящей системы сбора данных, подключенной через коммутатор. Для захвата низкочастотных частот используется частота дискретизации от 1 до 5 кГц. Более высокая частота дискретизации (20 - 30 кГц) требуется, если необходимо регистрировать одноблочные разряды вместе с LFP.
2. Сохраняйте необработанные файлы записей отдельных каналов для анализа в автономном режиме.

Результаты

Рисунок 1: Изображение инструмента для вставки. Силиконовый зонд прикреплен к штифту от насекомых, приклеенному к основанию зажима типа «крокодил». Стержень держателя может быть вставлен в стереотаксический микроманипулятор для имплантации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Зажим для крокодила с подставкой	Reichelt Elektronik	НЕДОУЗДОК ZD-10D
Силиконовый зонд	Кембриджский нейротех	Серия P 32
стереоскоп	Олимп	СЗ51
Медный провод с лакированной изоляцией	Bürklin Elektronik	89 Ф 232
Винтовые сваи	Screws & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
поток	Станнол	114018
Щипцы с керамическими наконечниками	Инструменты для точной науки	11210-60
Парафиновый воск	Сигма-Олдрич	327204
Прижигание	Инструменты для точной науки	18010-00
паяльник	Курц Эрза	OIC1300
этанол	Карл Рот	9065.1
Пастеровские пипетки	Карл Рот	ЕА65.1
Термостерилизатор	Инструменты для точной науки	18000-45
Стереотаксическая рама	Дэвид Копф	Модель 1900
Стереотаксический держатель электродов	Дэвид Копф	Модель 1900
Изофлуран	Аббви	В506
Кислородный концентратор	Респироникс	1020007
Бупренорфин	Индивидуор Юкан Лимитед
Электробритва	Тондео	Эко-XS
Грелку	Термолюкс	463265/-67
Хирургические зажимы	Инструменты для точной науки	18050-28
перекись водорода	Сигма-Олдрич	Н1009
Стерильные ватные салфетки	Карл Рот	ЭХ12.1
сверло	Proxxon	Микромот 230/Е
Игла для инъекций 21G	Б. Браун	4657527
Фосфатный буфер/фосфатный буферный раствор
Стереотаксический атлас	Эльзевир	9,78Э+12
Хирургические ножницы	Инструменты для точной науки	14094-11
Хирургические щипцы	Инструменты для точной науки	11272-40
Инъекционные иглы 27G	Б. Браун	4657705
вазелин
Стоматологический цемент	Сан Медикал	SuperBond T&M
Карпрофен	Зоетис	Римадил 50мг/мл
усилитель записи	Интан Технолоджис	С3323
Плата сбора данных через USB	Интан Технолоджис	С3004
Записывающие кабели	Интан Технолоджис	С3216
Электрический коммутатор	Дорические линзы	HRJ-OE_FC_12_HARW