Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Приготовление экспериментального решения
- Приготовьте раствор для препарирования за 1 день до 1 недели до фактического эксперимента. Используйте буферный раствор 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновой кислоты (HEPES) для диссекции сетчатки из-за его сильной буферной способности при более низких температурах16. Смешайте все химические вещества следующим образом (в мМ): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 глюкозы. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH. Храните раствор в холодильнике до 1 недели.
- Записывающим решением является среда Эймса, которая представляет собой искусственную спинномозговую жидкость (АКЦФ), предназначенную для препарирования сетчатки. Ко дню эксперимента отвесьте порошок Эймса (4,4 г на 500 мл раствора) в пробирке. Также взвесьте NaHCO3 (0,95 г на 500 мл раствора) и смешайте с порошком Эймса.
- Приготовьте раствор внутриклеточной пипетки для записи с помощью патч-хомута ко дню эксперимента. Смешайте все химические вещества следующим образом (в мМ): 111 K-глюконат, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 этиленгликоля тетрауксусной кислоты (EGTA), 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 АТФ-Mg и 1,0 GTP-Na. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью KOH. Отфильтруйте раствор пипетки с помощью обычного шприцевого фильтра. Приготовьте аликвоты объемом ~500 мкл и храните их в морозильной камере или морозильной камере.
2. Подготовка к дню эксперимента
- В ночь перед экспериментом поместите мышь в клетку (C57BL/6J или аналогичный фон, возраст 4–8 недель, самец) в темное пространство для ночной адаптации в темноте (O/N).
- Подготовка к вскрытию:
- Налейте раствор для препарирования (100 - 200 мл) в стеклянную мензурку, положите ее на лед и пузырите кислородом не менее 10 минут.
- Начните насыщение темного бокса кислородом для хранения препарата сетчатки.
- Подготовьте пластиковые покровные листы со смазочными рейками для подготовки срезов сетчатки и поместите каждый из них в пластиковую посуду диаметром 35 мм.
- Прикрепите новое лезвие бритвы к измельчителю (слайсеру для салфеток).
- Разрежьте фильтрующую мембрану на две половины. Это делается для разреза сетчатки.
- Выровняйте инструменты для препарирования и перенесите пипетки рядом с микроскопом для препарирования. Рабочая зона должна быть хорошо организована, чтобы каждый инструмент был легко доступен в темноте.
- Подготовка к записи патч-клэмпа:
- Растворите порошок Эймса и NaHCO3 в дистиллированной воде (Ames 4,4 г и NaHCO3 0,95 г/500 мл ddH2O). Пропузырите среду Эймса смешанным кислородом (95%O2 и 5%CO2) в течение не менее 30 минут, нагревая до рекордного уровня температуры (~35 °C). Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaHCO3 во время барботирования.
- Разморозьте внутренний раствор пипетки во время вскрытия. После того как он разморозится, добавьте 0,01% сульфородамина В для внутриклеточного окрашивания.
3. Записи с помощью патч-клэмпа из препарата среза сетчатки
- Подготовка к записи:
- Загрунтуйте перфузионные трубки средой Эймса. Дайте всем пузырькам пройти при заполнении трубки.
- Сделайте патч-зажим для записи пипеток с помощью съемника. Чтобы наполнить пипетку раствором для пипетки, опустите ее на заднюю сторону пипетки на 1 минуту, пока наконечник пипетки не заполнится обратно. Затем заполните ~1/3 пипетки с помощью наполнителя для микропипетки. Храните каждую пипетку во влажной коробке для пипетки.
- Включите оборудование для записи с помощью патч-клещей, включая компьютер, усилитель, камеру устройства с зарядовой связью (ПЗС) и микроскоп.
- Выключите свет в комнате. Поместите препарат среза сетчатки в камеру предметного столика микроскопа с помощью инфракрасного зрителя. После того, как он будет обездвижен, начинают непрерывную перфузию. Установите температуру перфузии на уровне от 33 до 37 °C.
- Просмотрите поверхность среза с помощью ПЗС-камеры. Сосредоточьтесь на целевом местоположении, где находятся целевые типы клеток. Выберите здоровую на вид ячейку для записи патч-хомута (т.е. она должна иметь гладкую поверхность и хорошую форму ячейки).
- Поместите записывающую пипетку в держатель для пипетки. Переместите пипетку к подготовке ломтика. Когда он приблизится к препарированию среза (~2 мм выше), найдите кончик пипетки с помощью микроскопа. Как только наконечник пипетки станет виден под микроскопом, переместите наконечник вниз по направлению к целевой клетке.
- Установите усилитель. Отрегулируйте пипетку на 0 мВ/0 пА (обнуление) и запустите непрерывный электрический импульс ~5 мВ при ~10 Гц. Проверьте сопротивление пипетки; идеальное сопротивление составляет от 5 до 10 МОм для большинства нейронов сетчатки.
- Начните продувать с кончика. Используйте мундштук или шприц для приложения положительного давления, когда пипетка погружается в раствор для ванны. Непрерывно выдувайте внутренний раствор до тех пор, пока наконечник не окажется на поверхности целевой клетки.
- Когда положительное давление сделает небольшую ямочку на поверхности клетки, немного придвиньте кончик вперед и прекратите выдувание. Проверьте сопротивление пипетки, которое должно увеличиться. Если оно постоянно увеличивается, оставьте его и следите за сопротивлением, пока оно не достигнет >1 ГОм (гигазал). Если сопротивление самопроизвольно не увеличивается, осторожно приложите отрицательное давление, пока оно не станет гигауплотнением.
- После того, как гигауплотнение будет достигнуто, измените потенциал удержания на -70 мВ. Затем периодически прикладывайте отрицательное давление, чтобы разорвать мембрану внутри наконечника пипетки. При конфигурировании цельной ячейки сопротивление пипетки может составлять от 500 МОм до 1 ГОм, а емкостный ток виден. Иногда могут наблюдаться спонтанные постсинаптические токи.
- Запишите зависимость ток-напряжение (ВАХ) от -80 до +40 мВ. В зависимости от типа ячейки активируются различные типы потенциал-зависимых каналов.
- Записывайте вызванные светом синаптические токи или напряжения.
