Субдуральная имплантация мягкой электрокортикографической матрицы для регистрации электрофизиологии коры головного мозга у минипигов

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Хирургическая имплантация мягких электрокортикографических массивов (ЭКоГ)

1. анестезия
   1. Премедикация: Изолируйте самок гёттингенских минипигов (n = 7) в возрасте 2-6 месяцев (5-8 кг) и голодайте на ночных стадиях. Введите смесь мидазолама в дозе 0,75 мг/кг, атропина в дозе 0,25 мкг/кг и халдола в дозе 0,1 мг/кг внутрикожно и подождите, пока животное не получит седативное средство. Взвесьте животное, прежде чем продолжить.
   2. Установка внутривенного (IV) провода:
      1. Поместите животное на операционный стол на грелку. Вызвать анестезию, наложив на животное маску для лица, используя севофлуран в концентрации 3%-3,5%.
      2. Электрокардиограмма должна быть помещена на брюшную полость, датчик сатурации крови — на хвост, а датчик температуры — в ноздрю.
      3. Поместите внутривенный ввод в ушную вену и подтвердите доступ крови с помощью шприца, наполненного физиологическим раствором. Следите за тем, чтобы глаза оставались увлажненными, используя мазь.
   3. Интубация: Введите болюс атракурия в дозе 0,5 мг/кг, кетамина в дозе 1 мг/кг и фентанила в дозе 1-2 г/кг. Положите животное на спину для интубации. Вставьте трубку диаметром 4,5 мм.
   4. Лекарственные препараты: После интубации прекратите анестезию севофлураном и установите инфузию пропофола в дозе 10 мг/кг/ч, фентанила в дозе 2 г/кг/ч, атракуриума в дозе 0,2-0,5 мг/кг/ч и физиологического раствора в дозе 4-7 мг/кг/ч. Начните инфузию маннитола в дозе 1 г/кг/ч, чтобы уменьшить отек мозга во время операции><. ПРИМЕЧАНИЕ: Мультимодальная схема анальгезии может быть использована, если это рекомендовано местным комитетом по этике животных.
2. Асептическое поле и подготовка кожи: Побрейте всю поверхность головы за пределами операционного поля. С помощью стерильной прокладки тщательно потрите голову бетадином. Затем положите стерильные простыни на стол с инструментами и на животное, чтобы открыть только операционное окно. Наконец, снова потрите голову стерильной салфеткой с использованием бетадина.
3. Краниотомия и дуротомия
   1. Разрез кожи: Надрежьте кожу ножом-скальпелем по средней линии. Отделите мышцу и надкостницу (25 мм латерально от брегмы с обеих сторон и 40 мм спереди и сзади от брегмы) от кости с помощью рашпатора и разместите распределители так, чтобы получить оптимальный доступ для последующего сверления.
   2. Измерения и маркировка: Определите брегму и лямбду и отметьте их стерильной хирургической ручкой (рис. 1A, B). С помощью стерильной линейки определите контур костного лоскута с центром вокруг мишени имплантации на обоих полушариях. В данном конкретном случае была выбрана слуховая кора с координатами от -5 мм до -15 мм от брегмы и от -4 мм до -20 мм латерально. Затем отрегулируйте трепанацию черепа в соответствии с размерами имплантата и анатомическими ориентирами, ограничив размер отверстия.
   3. Краниотомия:
      1. С помощью костяного сверла с круглым режущим сверлом сверлите контур трепанации черепа с учетом толщины черепа. Орошайте место сверления солевым раствором, чтобы избежать перегрева кости.
      2. Тщательно просверлите контур равномерно, пока не дойдете до твердой мозговой оболочки. При первом прорыве заканчивайте сверление контура до тех пор, пока он не истончится настолько, чтобы почти прорваться. Затем с помощью плоского шпателя (либо по средней линии, либо на боковой стороне) отломите костный лоскут на одну часть, используя край трепанации черепа в качестве рычага. Если сопротивление слишком велико, продолжайте истончать кость.
      3. Поместите кусочек кости в стерильный физиологический раствор.
      4. После того, как костный лоскут будет удален, осторожно отколите край трепанации черепа, используя керисон, чтобы острый край кости не врезался в твердую мозговую оболочку.
      5. При возникновении чрезмерного кровотечения на твердой мозговой оболочке или кости используйте гельпену или костный воск соответственно. Поместите влажный компресс (стандартную прокладку в стерильном физиологическом растворе) в трепанацию черепа и повторите этот шаг на другом полушарии (рисунок 1Б).
   4. Дуротомия:
      1. С помощью иглы из набора шовных нитей 6-0 осторожно проткните и поднимите твердую мозговую оболочку на переднем или заднем конце трепанации черепа на полпути между медиальной и латеральной стороной и создайте начало разреза ножом для ножа.
      2. Затем, используя небольшой плоский шпатель, вставленный в субдуральное пространство, выступающий в качестве режущей основы для защиты коры, создать переднезаднюю щель в твердой мозговой оболочке, продвигаясь одновременно обоими инструментами. Убедитесь, что щель немного больше ширины имплантата (рисунок 1C). Если на этом этапе произойдет какое-либо кровотечение или повреждение, накройте его гелевой пеной и подождите, пока она остановится.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Траектория разреза должна быть адаптирована, если в твердой мозговой оболочке присутствуют крупные кровеносные сосуды, чтобы избежать кровотечения.
4. имплантация
   1. Установка устройства:
      1. Орошите имплантат (Рисунок 2A) физиологическим раствором с обеих сторон, чтобы он легче скользил в субдуральное пространство. Поместите имплантат над щелью твердой мозговой оболочки и с помощью небольших щипцов субдурально вставьте устройство, последовательно скользя им по каждому краю.
      2. Осторожно придерживайтесь за пьедестал и продвигайтесь вместе с имплантатом, чтобы не создавать напряжения, препятствующего введению. Когда край соединителя окажется в верхней части щели, остановите вставку.
   2. Закрепите имплантат: Чтобы закрепить имплантат на месте, поместите титановый мост через кабель после края трепанации черепа или в анкерные крылья и закрепите его одним или двумя титановыми винтами с помощью соответствующей отвертки (Рисунок 1D).
   3. Установка заземления: Осторожно снимите 1 см изоляции проводов заземления и вставьте ее эпидурально в задний конец краниотомии (или в любом эпидуральном месте, удаленном от интересующей коры или крупных кровеносных сосудов) (провод на рисунке 1E)
   4. Повторите действия на контралатеральной полусфере.
   5. Закрытие твердой мозговой оболочки: Тщательно сшите твердую мозговую оболочку вокруг кабеля имплантата с помощью рассасывающегося шовного материала 3-0 и небольшого иглодержателя. Максимально сведите два края твердой мозговой оболочки, не разрывая тонкую мембрану с помощью шовной проволоки (рис. 1D, E).
   6. Установка костного лоскута: Зафиксируйте титановый мост на передней и задней части каждого костного лоскута с помощью титанового винта. Будьте внимательны при планировании расположения Ti-мостов по отношению к размещению ножек подножки на следующих шагах. Прикрутите конец титановых мостов к черепу (рисунок 1F, G).
5. Размещение пьедестала и подножки
   1. Расположение: В этой конфигурации подножка имеет шесть ножек с двумя отверстиями для винтов на каждой (Рисунок 2B). Спланируйте размещение подножки на черепе, чтобы оптимизировать расположение винтов (избегайте их размещения на краю трепанации черепа или в височной мышце). Пропустите отверстия в ножках, если их нельзя вкрутить.
   2. Крепление подножки: Вкрутите титановые винты подножки до тех пор, пока она не встанет на место (см. Рисунок 1H).
   3. Размещение пьедестала: Снимите титановые мосты над соединительными кабелями и переверните пьедестал, чтобы приземлиться на подножку. Прикрутите тумбу к подножке. Убедитесь, что пьедестал прочно установлен на месте (рисунок 1I).
6. Наложение швов и закрытие
   1. Очистка раны: Очистите подкожное пространство от костей или другого мусора путем промывания солевым раствором. Срежьте немного кожицы по краям пьедестала, чтобы создать круглый край вслед за цилиндром.
   2. Подкожные швы: Снимите раскройки и сложите кожные лоскуты вместе. Подкожные швы создаются с помощью нерассасывающейся шовной проволоки 4-0, расположенной на расстоянии 3 мм друг от друга, с помощью простых прерывистых швов или простых непрерывных швов. Начните в сторону от постамента, двигаясь к нему с обеих сторон от разреза.
   3. Кожные швы: Сшивайте кожу с помощью нерассасывающейся шовной проволоки 6-0, с расстоянием между швами 5 мм. Начните в сторону от постамента, двигаясь к нему с обеих сторон от разреза. Позаботьтесь о том, чтобы обеспечить хорошее прилегание тканей между двумя кожными лоскутами и рядом с краем пьедестала, чтобы избежать образования пустот (Рисунок 1J).
   4. Повязка на рану: Снова очистите область раны стерильной салфеткой и нанесите бетадин. Наложите на рану самоклеящуюся стерильную повязку.
7. Пробуждение: После проведения всех измерений снимите животное с всех анестетиков, но оставьте на искусственной вентиляции легких. Для обезболивания наложите пластырь с бупренорфином (25 мг/ч) на 24 ч. Положите животное на грелку, накрытую портьерами, чтобы ускорить время пробуждения. Когда спонтанное дыхание восстановится, экстубируйте животное и поместите его под кислородную маску для лица до тех пор, пока сознание не придет в себя (что может занять от 1 до 4 часов).
8. Послеоперационный уход за животным: В течение 5 дней держите животное под пристальным наблюдением. Давайте дозу цефалексина по 75 мг два раза в день с пищей, отдельно от других животных. Ежедневно проводите дезинфекцию раны, нанося обильное количество бетадина на смоченные стерильные прокладки (лучше всего во время кормления).
   заметка: Долгосрочный уход и содержание: Прооперированное животное содержится в изоляции в течение 24 часов. Он возвращается в свою первоначальную социальную группу, если животное достаточно хорошо себя чувствует, чтобы взаимодействовать со своими сверстниками. Необходимо проводить ежедневное наблюдение за пьедесталом и отверстием кожи, чтобы следить за интеграцией устройства на голове. Когда это уместно, очистите место вокруг пьедестала обильным количеством бетадина.

2. Электрофизиологическая запись

1. Спонтанная активность: Подключите беспроводную систему записи через пьедестал и записывайте базовую активность в течение 2-3 минут. Эти записи будут служить в качестве контроля для анализа слуховых вызванных потенциалов.
2. Слуховые вызванные потенциалы: В дополнение к беспроводной системе, вставьте динамики в закрытое поле в уши животных. Воспроизведение тональной взрывной акустической стимуляции на различных частотах (в диапазоне от 200 до 20 000 Гц) при уровне звукового давления (SPL) около 70 дБ в течение 120 повторений. Затем усредните записи и выровняйте их по периоду стимула для анализа.
3. Сенсорные вызванные потенциалы: поместите иглы в морду в трех разных положениях. Вызывайте сенсорные потенциалы, стимулируя рыло в течение ~30 с с помощью генератора импульсов с различной амплитудой для получения кривых рекрутирования.

3. Свободно движущаяся запись

1. Следуйте той же процедуре, которая описана в разделе 2 для записи сигналов бодрствующего состояния от мозга. Подключите беспроводную головку, держа животное на руках у экспериментатора или кормя его лакомствами, чтобы отвлечь его. Обеспечьте акустическую стимуляцию с помощью внешних динамиков, расположенных рядом с животным.

Рисунок 1: Минимально инвазивная имплантация мягкого ЭКоГ в мозг.(А) Хирургический доступ к черепу с признаками брегмы. (Б) Двусторонняя трепанация черепа с видимой твердой мозговой оболочкой. (В) Щелевая дуротомия на первом полушарии. (D) Субдуральная имплантация мягкой ЭКоГ и закрытие твердой мозговой оболочки. (E) Щелевая дуротомия на втором полушарии. Фиксация костным лоскутом на первом полушарии с помощью титановых мостов. (F) Имплантация мягкого ЭКоГ на втором полушарии и закрытие твердой мозговой оболочки. (G) Фиксация костным лоскутом на втором полушарии. (H) Положение подножки на черепе. (I) Фиксация пьедестала на подножке. (J) Обшивка вокруг основания пьедестала.

Рисунок 2: МРТ-совместимый пьедестал. (A) Хроническая МРТ-совместимая система трансдермального соединения (пьедестал) для доступа к решетке мягких электродов. (B) Постамент с электродами, установленными на подножке для крепления черепа. Вставка: Детали подножки.