Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Транскардиальная перфузия
- Подвесьте шприц емкостью 60 мл в качестве резервуара для раствора для резки сахарозы примерно на 18 дюймов над столешницей (например, с помощью поворотного зажима с тремя зубцами на вертикальном столбе). Прикрепите трубку к дну резервуара, пропустите трубку через роликовый зажим и подсоедините другой конец трубки к чистой игле 20 G.
- Наполните резервуар объемом 60 мл примерно 30 мл охлажденного раствора сахарозы и направьте карбогенную линию в резервуар с сахарозой, чтобы перфузат постоянно пузырился.
заметка: Убедитесь, что сахароза протекает через трубку и иглу без застрявших пузырьков. Скорость потока должна быть достаточно высокой, чтобы из иглы поступала устойчивая, непрерывная струя сахарозы.
- С помощью блендера измельчите и взбейте замороженную сахарозу в ледяную кашицу и с помощью большой лопатки/ложки распределите кашицу.
- Выложите небольшое количество сахарозной кашицы по краям стеклянной крышки чашки Петри. Добавьте небольшое количество кашицы сахарозы на дно чашки Петри.
- Добавьте примерно 20–30 мл суспензии сахарозы в резервуар для перфузионной жидкости, хорошо перемешав ее с 30 мл охлажденной жидкой сахарозы до тех пор, пока резервуар не будет содержать смесь очень холодной, преимущественно жидкой сахарозы с остатком замороженного раствора.
- Поместите мышь в камеру, подключенную к исофруранному испарителю. При потоке кислорода со скоростью примерно 2 л/мин поверните ручку испарителя, чтобы подать изофлуран в концентрации 5%, и запустите таймер.
заметка: Держите этот таймер включенным на протяжении всего процесса нарезки, чтобы оценить, как быстро получаются ломтики. Процедура должна быть выполнена как можно быстрее, чтобы срез был завершен, а ткань в интерфейсной камере восстанавливалась в течение 15–20 минут после того, как животное попало в изофлурановую камеру. Следите за мышью, чтобы убедиться в достижении состояния глубокой анестезии. По прошествии минимум 5 минут мышь должна быть глубоко обезболена и не реагировать на пощипывание пальцев ног.
- Непосредственно перед извлечением мыши из изофлурановой камеры заполните крышку чашки Петри охлажденным раствором сахарозы на глубину примерно 3–5 мм и заполните дно чашки Петри охлажденным раствором сахарозы на глубину примерно 1,0 см.
- Быстро перенесите мышь на левую впитывающую подушку и с помощью 3 кусков скотча закрепите передние конечности и хвост. Выполните сжатие пальцев задних конечностей, чтобы убедиться, что мышь не реагирует на любой разрез. Используя большие тканевые щипцы и хирургические ножницы, наложите тент на кожу и сделайте продольный разрез от нижней части грудины до верхней части грудной клетки. С помощью щипцов подтягиваем вверх на грудине и ножницами разрезаем диафрагму.<бр/>
заметка: Первоначальное положение мыши и первые несколько разрезов для разрезания диафрагмы должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы мышь не пришла в сознание. Чтобы обеспечить достаточную глубину анестезии на протяжении всей процедуры, на мышь может быть наложен носовой конус для доставки изофлурана во время перфузии.
- Используйте ножницы, чтобы разрезать грудную клетку с каждой стороны, разрезая одним большим движением к точке, где передняя конечность встречается с телом. С помощью щипцов откачайте переднюю часть грудной клетки в сторону и вверх по направлению к голове, а затем полностью удалите ее горизонтальным надрезом с помощью больших ножниц. Удерживайте сердце на месте с помощью больших щипцов и введите перфузионную иглу 20 G в левый желудочек. После того, как игла расположена правильно, левая сторона сердца должна быстро побледнеть, поскольку охлажденный раствор сахарозы заполняет желудочек.
- С помощью маленьких ножниц для диссектора разрежьте правое предсердие и дайте крови вытекать из кровеносной системы. Если разрезы выполнены правильно, повреждение сердца должно быть минимальным, и оно должно продолжать перекачивать кровь на протяжении всей перфузии.
заметка: Свернутые в рулон листы папиросной бумаги можно использовать для отвода крови и раствора сахарозы из сердца и поддержания видимости перфузионной иглы во время процедуры.
- Следите за тем, чтобы перфузионная игла оставалась на месте и не выпадала из левого желудочка. При правильной скорости потока и размещении печень начнет бледнеть до светло-коричневого/бежевого цвета через 20–30 секунд.
- Через 30–45 секунд с помощью больших ножниц обезглавьте мышь. Держа голову в левой руке, оттолкните или содрайте кожу с черепа. У хорошо отпертого животного череп должен быть очень бледным, а в головном мозге должен проступать очень светло-розовый цвет (приближающийся к белому) через череп без четко видимых кровеносных сосудов.
2. Извлеките мозг и нарежьте его ломтиками
- С помощью маленьких боннских ножниц сделайте два боковых разреза через череп по направлению к средней линии в передней части черепа, рядом с глазами. Сделайте по два дополнительных надреза с каждой стороны от основания черепа.
- Перенесите голову на дно стеклянной чашки Петри, где она должна быть в основном погружена в охлажденный раствор сахарозы. С помощью маленьких боннских ножниц разрежьте среднюю линию по длине черепа, подтягивая ножницами вверх, чтобы свести к минимуму повреждение подлежащих тканей мозга. С помощью маленьких тканевых щипцов крепко возьмитесь за каждую сторону черепа и поверните его вверх и в сторону от мозга, как будто открываете книгу.
- Пальцами левой руки держите лоскуты черепа открытыми и вставьте микрошпатель под мозг рядом с обонятельными луковицами. Переверните мозг из черепа в сахарозу и с помощью микрошпателя перережьте ствол мозга. Промойте мозг, чтобы удалить остатки крови, шерсти или других тканей.
- С помощью большого шпателя/ложки перенесите мозг на крышку стеклянной чашки Петри. Отложив в сторону вторую половину обоюдоострого бритвенного лезвия, сделайте два корональных надреза, чтобы сначала удалить мозжечок, а затем самую переднюю часть мозга, включая обонятельные луковицы (рис. 1).
- Нанесите цианоакрилатный клей на рампу агара. Очень коротко поместите мозг на лист сухой фильтровальной бумаги с помощью больших тканевых щипцов, а затем немедленно перенесите его на агаровый пандус, поместив вентральную поверхность мозга на клей><.
заметка: При срезах промежуточного гиппокампа мозг должен быть ориентирован передней стороной вверх по склону пандуса, а задней ближе к лопатке. Для срезов вентрального гиппокампа ориентируйте мозг так, чтобы передний конец был направлен вниз по склону пандуса, а задний конец находился в верхней части пандуса, дальше от лопасти. В любом случае, мозг должен быть расположен в верхней части рампы таким образом, чтобы коронарно разрезанная поверхность мозга соприкасалась с агаровым подложным блоком (рис. 1).
- Поместите платформу для нарезки с агаром и мозгом в камеру для нарезки микротома и полностью погрузите в охлажденный раствор сахарозы. С помощью большой лопатки/ложки переложите немного суспензии сахарозы в камеру, помешивая, чтобы замерзшая сахароза растаяла и быстро снизила температуру смеси до ~1–2 °C.
заметка: Следите за указателем температуры на протяжении всей нарезки. Если раствор сахарозы нагревается выше 3 °C, добавьте еще суспензии и перемешайте, чтобы снизить температуру.
- Нарежьте ломтики толщиной 450 мкм со скоростью микротома 0,07 мм/с. Когда каждый срез будет освобожден, используйте маленькие тканевые щипцы и острый скальпель, чтобы сначала разделить два полушария, а затем отрезать ткань, пока срез не будет состоять в основном из гиппокампа и парагиппокампа (Рисунок 1).
- Используйте пластиковую трансферную пипетку для переноса срезов по отдельности в камеру восстановления границы раздела, следя за тем, чтобы они располагались на границе между ACSF и воздухом и покрывали срезы только тонким мениском искусственной спинномозговой жидкости (ACSF). Плотно закройте крышку камеры и дайте ломтикам восстановиться при температуре 32 °C в течение 30 минут.
- После первоначального восстановления при температуре 32 °C выньте камеру восстановления интерфейса из водяной бани и установите мешалку, установленную на медленную скорость, чтобы магнитная мешалка способствовала циркуляции ACSF внутри камеры. Дайте ему постепенно остыть до комнатной температуры, пока ломтики восстановятся еще 90 минут. Следите за тем, чтобы камера восстановления постоянно пузырилась карбогеном, и не допускайте попадания крупных пузырьков под ломтики.
3. Выполнение записи локального потенциала поля (LFP) спонтанной активности
- Подготовьтесь к записи LFP, включив все необходимое оборудование, включая компьютер с программным обеспечением для сбора данных, монитор, подключенный к компьютеру, стимуляторы, микроманипулятор, регулятор температуры, источник света микроскопа, камеру, подключенную к микроскопу, усилитель микроэлектродов, дигитайзер и перистальтический насос. Если вы используете центральную вакуумную систему, откройте настенный клапан, чтобы подготовить вакуумную линию, которая удалит ACSF из записывающей камеры.
- Наполните нагретый резервуар ACSF, затем поместите один конец трубки в стакан объемом 400 мл, содержащий пузырящийся ACSF. Включите перистальтический насос, чтобы направить ACSF из стакана объемом 400 мл в нагретый резервуар, а из резервуара — в камеру записи. Постучите или сожмите трубку, чтобы выпустить застрявшие пузырьки.
- Отрегулируйте перистальтический насос так, чтобы скорость потока ACSF через записывающую камеру была высокой (~ 8–10 мл/мин). С помощью датчика температуры убедитесь, что ACSF составляет 32 °C в центре записывающей камеры.
заметка: Если ACSF подается в записывающую камеру с помощью перистальтического насоса, высокая скорость потока может привести к значительным колебаниям расхода. Постоянный расход может быть достигнут с помощью простого гасителя пульсаций, состоящего из ряда пустых шприцев, встроенных в трубку (Рисунок 2).
- Подготовьте стимуляционные и регистрирующие пипетки из капилляров из боросиликатного стекла с помощью нагретого пуллера филамента. Протокол пуллера должен быть сконфигурирован таким образом, чтобы получать пипетки с сопротивлением 2–3 МОм для стимуляции или электроды, регистрирующие потенциал локального поля.
- Дозаторы стимуляции заполняются 1 М NaCl и пипетки LFP с помощью ACSF.
- Кратковременно зажмите трубку и выключите насос, чтобы приостановить подачу ACSF. Перенесите срез в записывающую камеру с помощью тонких щипцов, чтобы ухватиться за уголок бумаги для линз, на котором лежит ломтик, — срез прилипнет к бумаге для линз. Поместите бумагу для линз и разрежьте ее в камере записи срезом вниз, затем «отклейте» бумагу для линз, оставив срез погруженным в камеру записи. Закрепите ломтик с помощью арфы.
заметка: Арфы можно приобрести в готовом виде или сделать в лаборатории с использованием U-образного куска нержавеющей стали или платины и тонкой нейлоновой нити.
- Поместите наполненную NaCl стимулирующую пипетку в ручной микроманипулятор и медленно продвигайте кончик пипетки на поверхность среза (например, в слой лучистого слоя) под углом примерно 30–45°. Как только кончик пипетки войдет в ткань, медленно продвигайте пипетку вперед и воздерживайтесь от больших движений в боковом или вертикальном направлении, которые могут излишне повредить аксоны в пределах среза. Поместите кончик пипетки на глубину не менее 50–100 мкм в срез, чтобы избежать повреждения клеток вблизи поверхности во время разрезания.
- Поместите пипетку LFP, наполненную ACSF, в держатель для пипетки, прикрепленный к моторизованному микроманипулятору. Приложите очень легкое положительное давление, используя либо давление рта, либо шприц объемом 1 мл, подключенный через клапан запорного крана и короткую трубку к держателю пипетки.
заметка: Расположите пипетки LFP внутри среза для регистрации интересующих сигналов: в случае резкой волновой ряби одну пипетку LFP следует поместить в пирамидальный слой (SP), а вторую пипетку — в лучистый слой (SR). Такая конфигурация позволяет одновременно регистрировать отрицательную острую волну в СИ и высокочастотную пульсацию в СП (рис. 3).
- С помощью микроманипулятора медленно продвигайте кончик пипетки LFP в интересующую область (например, в слой пирамидальных клеток CA1) под углом приблизительно 30–45°. Поместите кончик пипетки на глубину не менее 50–100 мкм в срез, чтобы избежать повреждения клеток вблизи поверхности во время разрезания. Во время усовершенствования пипетки LFP непрерывно подавайте небольшой импульс тестирования напряжения с помощью программного обеспечения для сбора данных и следите за резким увеличением сопротивления электродов. Это может указывать на то, что пипетка была забита или прижата к клетке.
- После того как пипетка LFP будет расположена в интересующей области, осторожно сбросьте положительное давление, открыв клапан на трубке, прикрепленной к держателю пипетки.
- Чтобы одновременно зарегистрировать LFP во втором месте, повторите шаги 6.8–6.10 со второй пипеткой и микроманипулятором.
- Используйте микроэлектродный усилитель в конфигурации токового клеща для регистрации спонтанной активности в потенциале локального поля после использования функции мостового баланса в программном обеспечении для сбора данных для коррекции последовательного сопротивления пипетки. Спонтанные островолновые волны (КСВ) будут проявляться в виде положительных отклонений внеклеточного потенциала слоя SP (рис. 3).
- Чтобы зарегистрировать вызванные полевые потенциалы, используйте стимуляторы, подключенные к дигитайзеру, чтобы подать короткий (200 мкс) импульс квадратного напряжения через дозатор для стимуляции, заполненный NaCl. Отрегулируйте диск напряжения стимуляции, чтобы вызвать диапазон амплитуд отклика.
