Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Настройка электрофизиологической записи
- Прикрепите кожу наружного уха мыши (ушной раковине) к основанию записывающей камеры, выстланному PDMS, тонкими булавками от насекомых по краям (~6-8 на каждое ухо), расположив очищенные нервы у основания уха рядом с двумя всасывающими электродами – одним для записи (для взятия нерва), а другим безразличным электродом (для подачи нейтрального сигнала на дифференциальный усилитель).
- Для записывающего электрода тщательно подбирайте отверстие и внутренний диаметр отверстия в соответствии с общей толщиной двух нервов, чтобы они прилегали как можно плотнее и на как можно большую длину.
- Втяните нервы в электрод путем легкого отсасывания из шприца объемом 2 мл, прикрепленного к другому концу с помощью трубки из силиконовой резины. Убедитесь, что нервы прямые, не сложены и не сложены вдвое.
- Разработайте посадку с высоким электрическим сопротивлением/импедансом, используя более сильное всасывание для втягивания соединительной ткани или жировой ткани для формирования пробки, которая плотно закрывает отверстие вокруг нерва.
- Другой (безразличный) электрод заполнить физиологическим раствором путем отсасывания, если это необходимо (он может быть заполнен капиллярным действием).
- Поместите идентичные записывающие провода (серебряные или платиновые) во внутреннее отверстие записывающих электродов для контакта с физиологическим раствором и нервом (записывающим) или зауженным, отполированным огнем концом (безразличным) электрода. Каждый электрод припаян индивидуально к разным жилам двухжильного экранированного кабеля. Поместите электрод для ванны (заземления) (гранулы Ag/AgCl) в ванну и прикрепите его к экрану двухжильного кабеля, подключенного к записывающим электродам.
- Подайте электрическую активность от двух электродов в отдельные каналы дифференциального усилителя, фильтра (полоса пропускания 0,2-2 кГц) и посмотрите на экран осциллографа. Убедитесь, что уровни электрического шума в канале А (запись) и канале В (безразличном) выглядят одинаково. На этом этапе может оказаться невозможным увидеть нормальные потенциалы спонтанного действия в канале А до тех пор, пока два электрода не будут уравновешены.
- Устранение любых различий в фоновом шуме между электродами путем увеличения импеданса записывающих электродов (канал А) или безразличных (канал В) электродов. Для этого путем дальнейшего втягивания ареолярной (жировой) соединительной ткани в любой из электродов и/или приложения большего усилия всасывания к шприцу объемом 50 мл.
- После того, как вы «сбалансированы» таким образом, переключитесь обратно на дифференциальную запись (A-B) и ищите потенциалы спонтанного действия (AP) в следе или при поглаживании волосков по краю ушной раковины. Если активности (спайкинга) не наблюдается, повторно проверьте плотное прилегание нерва в регистрирующем электроде и ареолярной соединительной ткани в безразличном электроде – обычно, чем плотнее (выше сопротивление) уплотнение и чем равнее импеданс в двух электродах, тем лучше. С практикой это позволит добиться хорошего качества (>2:1) соотношение сигнал:шум.
- Запишите электронейрограмму с помощью лабораторного интерфейса и электрофизиологического программного обеспечения, работающего на компьютере. Звуковой выход спайкинга очень полезен и может быть достигнут путем подачи нейрограммы через усилитель звука и связанный с ним громкоговоритель. Отрегулируйте порог так, чтобы он был чуть выше базового уровня шума (определяемого по отсутствию «шипения» белого шума).
- Чтобы увеличить доступ лекарственного препарата или флуоресцентного стирилового красителя к ланцетным окончаниям, осторожно отшелушите подкожный жировой слой возле края ушной раковины, открыв окно размером ~5 мм х 5 мм, обнажив дерму и основание фолликулов (рис. 1А, В).
- Прикрепите складку ~1 мм очищенной от жировой ткани кожи уха по переднему краю (на уровне только что созданного окна, если применимо), оставив прозрачный, заполненный солевым раствором зазор между прилегающими слоями кожи. Аккуратно поглаживайте волоски, выступающие по загнутому краю, булавкой или заземленными тонкими щипцами, не касаясь кожи, чтобы определить область максимального выхода AP на осциллографе и характерные «щелчки» и «хлопки» на аудиовыходе.
2. Регистрация потенциалов действия, вызванных стимулом
- Расположите датчик механической стимуляции – боросиликатное микроэлектродное стекло диаметром 10 см, прикрепленное к керамическому пьезоэлектрическому приводу, – так, чтобы движение было параллельно кожной складке. Поместите кончик примерно в 0,5-1 мм от кожной складки, чтобы он касался волосков, но не кожи. Проверьте эффективность стимуляции, медленно перемещая кончик зонда вручную, чтобы отклонить волоски, и наблюдайте/слушайте всплески.
- Используйте программное обеспечение для механической стимуляции 1-3 волос (например, 3 секунды при синусоидах 5 Гц, каждые 10 секунд смещение зонда на 200-500 мкм) и запишите вызванные стимуляцией реакции в нервах.
- Дайте несколько одинаковых последовательностей механической стимуляции с интервалом в 10 секунд. Оптимизируйте положение зонда для повторяемости, затем уменьшите частоту стимуляции в соответствии с протоколом эксперимента (например, частота повторения падения с 10 секунд до 30 секунд).
- Используйте программное обеспечение для различения активности, подобной точке доступа, например, используя простой порог, установленный на ~2-кратную амплитуду высокочастотного шума и ~25% самых больших точек доступа.
- Подсчитывайте AP, пересекающие пороговое значение, как «события», количественно оценивая частоту и характеристики производимых AP.
3. Запись возбуждения, вызванного стимулом, в сочетании с мечением N-(3-триэтиламмонийпропил)-4-(4-(дибутиламино)стирил) дибромида пиридиния
- Чтобы изучить влияние стирильных красителей на вызванное стимулом афферентное возбуждение и терминальную маркировку, добавьте соответствующую концентрацию выбранного стирилового красителя в раствор для купания и продолжайте электрическую запись.
- По истечении необходимого времени воздействия (обычно не менее 30 мин) подготовьте препарат к осмотру фолликулов. Разверните кожный лоскут, удалив фиксирующие штифты, и обнажите очищенную область кожи, чтобы обнажить терминальную маркировку.
- Смойте наружный краситель солевым раствором без красителей, сделав 3 полные смены физиологического раствора.
- Инкубировать в окончательной смене газообразного безкрасящего физиологического раствора в течение 10-15 минут, чтобы обеспечить выщелачивание наиболее стойких загрязнений красителями с открытых/внешних мембран.
- Неинтернализованный краситель, оставшийся на мембранах, удалить секвестрирующим агентом (сульфобутилированный бета-циклодекстрин, 1 мМ, 5 мин) в физиологическом растворе.
- Перенесите записывающую камеру в столик вертикального эпифлуоресцентного микроскопа и зафиксируйте камеру с механизмом перемещения предметного столика/предметного стекла.
- Осветите препарат возбуждающим светом, подходящим для стирилового красителя. Используйте объектив 10-кратного или 25-кратного флуоресцентного микроскопа для наблюдения за мечением фолликулов (рисунок 1).
