Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка электродов и кабелей для записи ЭЭГ/ЭМГ
- Подготовьте записывающий электрод для ЭЭГ/ЭМГ в соответствии со следующей процедурой.
заметка: Электрод является одноразовым и может быть использован только для 1 животного. Тщательно спланируйте конфигурацию проводки для всех разъемов. Разместите метки на разъемах для правильной ориентации.
- Припаяйте каждый контакт 4-контактного разъема к проволоке из нержавеющей стали толщиной 2 см. Короче говоря, прижмите один конец провода к штырю, поместите горячий паяльник на соединение провода и штифта и расплавьте немного припоя, чтобы достаточное количество припоя плавно проникло в соединение. Будьте осторожны, чтобы не нагреть булавку слишком сильно; В противном случае пластик вокруг контактов расплавится.
- Припаяйте свободный конец каждого из 2 проводов, прикрепленных к контактному разъему, к головке винта из нержавеющей стали диаметром 1,0 мм. Короче говоря, держите свободный конец провода на резьбе ниже головки винта, поместите горячий паяльник на соединение проволоки и винта и расплавьте немного припоя, чтобы убедиться, что достаточное количество припоя плавно проникает в соединение. 2 провода с винтами служат записывающими электродами ЭЭГ, а 2 провода без винтов служат записывающими электродами ЭМГ.
- С помощью ножниц снимите изоляцию на 1 мм на конце электродов ЭМГ, чтобы повысить качество сигнала ЭМГ.
- Полностью покройте все паяные контакты эпоксидным клеем с помощью тонкой деревянной палочки или зубочистки, чтобы уменьшить электрический шум во время записи ЭЭГ/ЭМГ.
- Подготовьте кабель для соединения электрода с контактным кольцом, как описано ниже. Этот кабель можно использовать повторно.
- Припаяйте каждый контакт 4-контактного разъема FFC/FPC с проводом плоского кабеля длиной 30 см. Короче говоря, прижмите зачищенный конец провода к штифту, поместите горячий паяльник на соединение проволоки и расплавьте немного припоя, чтобы достаточное количество припоя плавно проникло в соединение.
Примечание: Выберите длину плоского кабеля, соответствующую высоте клетки для экспериментального животного, используемой для записи ЭЭГ/ЭМГ.
- Припаяйте обжимные гнезда к кончику проводов на другом конце плоского кабеля. Короче говоря, приложите обжимное гнездо к зачищенному свободному концу провода, поместите горячий паяльник на соединение провода с гнездом и расплавьте немного припоя, чтобы убедиться, что достаточное количество припоя плавно проникает в соединение.
- Вставьте каждую обжимную головку в 4-позиционный обжимной корпус.
- Полностью покройте обжимные гнезда эпоксидным клеем с помощью тонкой деревянной палочки или зубочистки.
2. Имплантация электродов в голову мыши (Продолжительность: около 20 минут)
- Перед операцией простерилизуйте все хирургические инструменты в стерилизаторе с горячими шариками. Обезболить самца мыши (возраст 10 - 20 недель, 20 - 30 г) внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала (50 мг/кг). Убедившись, что мышь глубоко обезболилась путем защемления пальца ноги, сбрейте волосы на голове и шее машинками для стрижки.
- Переместите мышь в стереотаксическую рамку и зафиксируйте голову между 2 ушными планками. Нанесите вазелин на глаза, чтобы предотвратить сухость. Очистите выбритую кожу спиртом и разрежьте ее по средней линии скальпелем, чтобы обнажить череп. Зафиксируйте кожу, чтобы область операции оставалась открытой.
- С помощью твердосплавной фрезы (размер сверла: диаметр 0,8 мм) просверлите 2 отверстия в черепе, одно над лобной кортикальной областью (1 мм спереди от брегмы, 1,5 мм латерально от средней линии), а другое над теменной областью (1 мм перед лямбдой, 1,5 мм латерально до средней линии) правого полушария, согласно стереотаксическим координатам Паксиноса и Франклина.
- С помощью ювелирной отвертки вставьте в отверстия винты для записи ЭЭГ из нержавеющей стали и сделайте 2 - 2,5 оборота для каждого винта для эпидурального позиционирования над корой><.
Примечание: Не вставляйте винты слишком глубоко, чтобы предотвратить повреждение тканей мозга. Убедитесь, что винты плотно закреплены на черепе. Это важно для того, чтобы иметь стабильные сигналы ЭЭГ в течение длительного периода многократных записей (как правило, более 1 месяца). Извилистые винты производят артефакты ЭЭГ и могут оторваться до окончания экспериментального графика.
- Закрепите электрод в сборе (см. раздел 1.1, штифты обращены вверх) с помощью мгновенного клея к черепу и заклейте его стоматологическим цементом. Сделайте с обеих сторон небольшие отверстия щипцами в трапециевидных мышцах (мышцах шеи) и вставьте в отверстия проволоку из нержавеющей стали, которая служит электродами ЭМГ. Сшить кожу шелковой нитью (диаметром 0,1 мм) во избежание обнажения мышцы.
- Извлеките мышь из стереотаксической рамки. Вводите ампициллин (100 мг/кг) и мелоксикам (1 мг/кг) внутрибрюшинно, чтобы избежать бактериальной инфекции и уменьшить послеоперационную боль соответственно. Держите мышь на грелке и следите за ней, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной. Во время восстановления мышь размещайте индивидуально, чтобы избежать удаления электродов другими животными, и вводите мелоксикам (1 мг/кг) внутрибрюшинно в первые сутки после операции.
3. Запись и получение данных ЭЭГ/ЭМГ
- После 1-недельного периода восстановления поместите каждую мышь по отдельности в экспериментальную клетку, помещенную в звуконепроницаемую камеру звукозаписи. Поддерживайте температуру окружающей среды 23 ± 1 °C и автоматически контролируйте циклы 12-часового света/12-часового темноты (свет включается в 08:00, интенсивность освещения ~ 100 люкс).
- Подключите электрод ЭЭГ/ЭМГ на головке мыши к записывающему кабелю. Убедитесь, что записывающий кабель подключен к контактному кольцу (которое сконструировано таким образом, чтобы движения мыши не ограничивались скручиванием кабеля) и усилителю сигнала ЭЭГ/ЭМГ. Фильтрация сигналов ЭЭГ/ЭМГ (ЭЭГ, 0,5-64 Гц; ЭМГ, 16-64 Гц), оцифровывают с частотой дискретизации 128 Гц с помощью аналого-цифрового преобразователя (АЦП) и, наконец, записывают на компьютер с программным обеспечением для записи ЭЭГ/ЭМГ.
- Приучайте мышь в течение 2 - 3 дней в камере записи.
- Затем запустите программное обеспечение для записи ЭЭГ/ЭМГ.
- Выберите вкладку «Информация о файле данных» и установите флажок рядом с именем файла. Введите имя файла и нажмите «Сохранить».
- Выберите вкладку «Условия записи» и выберите все каналы ЭЭГ/ЭМГ, которые будут записываться.
- Выберите частоту дискретизации (128 Гц) во вкладке «Условия записи».
- Проверьте, правильно ли отображаются выбранные каналы во вкладке «Информация о каналах».
- Выберите вкладку «Настройка таймера» и нажмите «Монитор», чтобы отобразить ЭЭГ и ЭМГ.
- Проверьте, правильно ли отображаются сигналы ЭЭГ/ЭМГ.
- Выберите вкладку «Настройка таймера» и установите время на часах для начала и окончания записи в области «Основной таймер».
- Нажмите «Монитор» во вкладке «Настройки таймера», чтобы начать запись.
- Записывайте сигналы ЭЭГ/ЭМГ в соответствии с базовым уровнем (т.е. поведение свободно ведущей мыши во время сна/бодрствования). Усыпите мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала (200 мг/кг) после последнего дня эксперимента.
