Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Препарирование и подготовка ЦНС личинки дрозофилы
ПРИМЕЧАНИЕ: Методы диссекции ЦНС личинок ясно проиллюстрированы у Хафера и Шедля, но эти ранее опубликованные методы уменьшают длину нисходящих нейронов, которые важны для измерения частоты спайков. Здесь описывается дополнительный метод иссечения личиночной ЦНС, которая поддерживает длинные, неповрежденные нисходящие нейроны.
- Солевой препарат.
- Приготовьте для вскрытия и записи физиологический раствор до следующего значения в мМ: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоты (HEPES); титруйте pH до 7,25.
- Препарируйте личиночную ЦНС дрозофилы.
- Определите и извлеките блуждающую Drosophila melanogaster третьего возраста из флакона для культуры и поместите в нее 200 мкл физиологического раствора (рис. 1A).
- Возьмитесь за крючки для рта парой тонких щипцов и обхватите брюшную полость личинки второй парой щипцов (Рисунок 1B).
заметка: Не надавливайте слишком сильно на живот, так как это может привести к разрыву тонкого кутикулярного слоя личинки.
- Осторожно потяните за крючки для рта и брюшко в разных направлениях, чтобы отделить хвостовой конец личинка от области головы и обнажить внутренности личинки (Рисунок 1C).
заметка: ЦНС будет переплетена с трахеей и пищеварительным трактом. Не отделяйте ЦНС от тканей, чтобы предотвратить перерезание нисходящих периферических нервов.
- Выведите ЦНС из пищеварительного тракта и трахеи с помощью щипцов (рисунок 1D).
- При необходимости нарушить гематоэнцефалический барьер, вручную пересектив ЦНС позади мозговых долей пружинными ножницами Ваннас.
заметка: Это следует делать, исходя из физико-химических свойств используемого химического вещества. Красная линия на рисунке 2А — это предполагаемая точка пересечения и пересеченная ЦНС с неповрежденными нисходящими периферическими нервными стволами, показанными на рисунке 2В. Разрезанная ЦНС готова к экспериментам после завершения шага 1.2.5.
2. Внеклеточная запись ЦНС дрозофилы.
- Подготовьте ЦНС к записи.
- Протяните стеклянный электрод для пипетки от капилляров боросиликатного стекла с сопротивлением 5-15 мОм.
- Вставьте рассеченную ЦНС в восковую камеру, содержащую 200 мкл физиологического раствора. Зажмите штифт без покрытия с помощью зажима типа «крокодил», припаянного к заземляющему проводу, и вставьте штифт в солевой раствор, чтобы завершить цепь.
- С помощью микроманипуляторов ориентируют электрод на каудальный конец разрезаемой ЦНС. Исключите запись фонового шума, отрегулировав пороговый уровень в программном обеспечении для сбора/анализа данных перед контактом с периферическими нервными стволами.
- Втяните любые удобные периферические нервы в отсасывающий электрод, слегка надавливая на шприц.
заметка: Базовая частота возбуждения коррелирует с количеством нейронов, втянутых в электрод, где большее количество нейронов часто приводит к увеличению сопротивления электрода.
- Начните внеклеточную регистрацию активности нисходящего нерва ЦНС.
- Запустите запись в программном обеспечении для сбора данных и отслеживайте базовую частоту срабатывания. Дайте скорости срабатывания стабилизироваться в течение 5 минут, прежде чем собирать данные о базовой скорости срабатывания.
- Откажитесь от подготовки и записи, если схема срабатывания контрольной обработки не является схемой разрыва, аналогичной показанной на рисунке 3A.
заметка: Измененный паттерн возбуждения предполагает аномальную или нестабильную активность центрального генератора паттернов, которая может изменить нейронную функцию.
- Через 5 минут добавьте 200 μL физиологического раствора + транспортное средство, чтобы довести общий объем камеры до 400 μL для начала регистрации контрольных скоростей стрельбы.
- После установления исходного уровня (3-5 мин) извлеките 200 μл физиологического раствора и добавьте 200 μЛ экспериментального средства, растворенного в физрастворе.
заметка: Диметилсульфоксид (ДМСО) является рекомендуемым растворителем для липофильных соединений и не должен превышать 0,1% v/v.
- Применяйте концентрации препарата последовательно (от низких до высоких концентраций) и регистрируйте каждую концентрацию в течение выбранного периода времени (определяемого исследователем на основе химических свойств препарата). Обозначьте этот момент времени применения препарата в программном обеспечении для сбора/анализа, включив комментарий, включающий препарат и конечную концентрацию.
заметка: Активность возбуждения ЦНС снижается примерно на 10-20% через 30-50 минут после вскрытия, поэтому следует проводить соответствующий нелеченный контроль, а медикаментозное лечение не должно превышать этот период времени.
