Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Подготовка к настройке MEA
Примечание: Начните за 15 минут до записи.
- Переложите оставшийся объем 4AP-ACSF (4-аминопиридиновая искусственная спинномозговая жидкость) в колбу Эрленмейера объемом 500 мл.
- Поместите колбу Эрленмейера на полку над усилителем MEA (Microelectrode arrays) и с помощью трубки обеспечьте непрерывную подачу раствора в шприц объемом 60 мл. Отрегулируйте высоту колбы Эрленмейера и шприца так, чтобы скорость подачи под действием силы тяжести составляла 1 мл/мин.<бр/>
заметка: Правильная высота зависит от внутреннего диаметра трубки (ID). Для трубки с внутренним диаметром 5/32 дюйма достаточно 30 см.
- Начните барботировать 4AP-ACSF в колбе Эрленмейера и в шприце газовой смесью 95% O2/5% CO2.
- Дайте 4AP-ACSF течь через перфузионную трубку в стакан до тех пор, пока внутри не останется воздуха; затем остановите поток раствора.
- Подключите нагревательный элемент в основании MEA к термостату. Поместите сухую микросхему MEA внутрь усилителя MEA и закрепите головку усилителя. Пластиковый дозатор Пастера подает 4AP-ACSF на вход и внешний резервуар записывающей камеры.
- Закрепите нагревательную канюлю на магнитном держателе и поместите ее наконечник внутрь входного отверстия записывающей камеры. Прикрепите магнитный держатель к магнитной полосе на головке усилителя MEA. Подсоедините перфузионную трубку к канюле. Подключите канюлю к термостату.
заметка: Нагревательная канюля должна быть закрыта скошенной трубкой из политетрафторэтилена (ПТФЭ), чтобы достичь входного отверстия записывающей камеры и свести к минимуму шум благодаря металлическому материалу. Когда входной резервуар достаточно заполнен 4AP-ACSF, капли, падающие из перфузионной системы, не должны быть видны.
- Поместите всасывающую иглу внутрь резервуара и убедитесь в наличии отрицательного давления, погрузив ее в ACSF; проверьте наличие постоянного низкочастотного шума всасывания.
заметка: Аспирационная игла должна быть размещена таким образом, чтобы 4AP-ACSF протекал непосредственно над поверхностью среза мозга. Можно использовать вакуумную линию или вакуумный насос с низким уровнем шума.
- Установите регулятор расхода так, чтобы он обеспечивал расход 1 мл/мин, и начните перфузию.
заметка: Перфузия с гравитационной подачей устраняет шум, который может быть вызван перистальтическими насосами; Если предпочтение отдается перистальтическим насосам, то в обязательном порядке требуются модели с низким уровнем шума.
- Как только 4AP-ACSF пройдет через канюлю, включите термостат. Установите нагревательную канюлю на 37 °C, а основание MEA на 32 °C, чтобы достичь температуры 32 - 34 °C внутри записывающей камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ! Никогда не нагревайте канюлю без раствора, иначе она может быть необратимо повреждена. Установите температуру канюли выше температуры записи (т.е. 32 - 34 °C), чтобы учесть внутренний температурный сдвиг между заданным значением и фактическим значением на кончике нагревательной канюли и в камере записи. Скорость потока, температура окружающей среды и объем записывающей камеры влияют на температуру записывающего раствора. Настройки, указанные на шаге 1.9, оптимизированы для описанного протокола и оборудования. Всегда проверяйте фактическую температуру записи с помощью термопары и при необходимости регулируйте настройки. Не нагревайте основание MEA выше 34 °C, чтобы избежать перегрева среза мозга.
- Поместите внешний электрод сравнения во входной резервуар записывающей камеры.
заметка: Несмотря на то, что микросхемы MEA оснащены внутренним электродом сравнения, специальная записывающая камера покрывает эту функцию. Таким образом, необходимо использовать внешний электрод сравнения. Насыщенная гранула KCl (хлорид калия) является наиболее практичной, поскольку она готова к использованию без необходимости хлорирования.
2. Отображение в реальном времени MEA
- После того, как уровень 4AP-ACSF и температура записи стабилизируются по желанию, поверните перфузионные и всасывающие запорные краны в выключенное положение, чтобы временно остановить их.
- Быстро перенесите один срез мозга в записывающую камеру MEA с помощью пипетки Пастера из перевернутого стекла. При необходимости отрегулируйте его положение в области записи MEA с помощью отполированной до блеска изогнутой пипетки Пастера (рис. 1C) или мягкой компактной кисти. Поместите прижимной якорь (рисунок 1D) на срез мозга. Возобновите перфузию и всасывание, вернув их запорные краны обратно во включенное положение.
ПРИМЕЧАНИЕ: КРИТИЧНО! Срез должен быть перенесен, и перфузия должна быть возобновлена в течение 60 секунд, иначе ткань может погибнуть. Прижимной якорь среза следует держать в 4AP-ACSF, чтобы предотвратить движение среза мозга при размещении якоря на срезе мозга из-за разницы в поверхностном натяжении. Анкер для крепления среза мозга к MEA может быть изготовлен на заказ с использованием проволоки из нержавеющей стали и нейлоновой нити (рис. 1D) или получен из коммерческих источников. На рисунке 1E показана окончательная экспериментальная установка с чипом MEA, подключенным к головке усилителя: срез мозга, лежащий на чипе MEA в камере записи, удерживается специальным якорем. Электрод сравнения (красный круг) и трубка из ПТФЭ, закрывающая нагревательную канюлю (красная стрелка), расположены во входном резервуаре, а всасывающая игла (синяя стрелка) — в выпускном резервуаре.
- Сфотографируйте срез мозга с помощью камеры, установленной на перевернутом предметном столике микроскопа.
- Запустите скрипт mapMEA в компьютерном программном обеспечении, чтобы запустить графический интерфейс для отображения электродов.
заметка: Специально разработанное программное обеспечение позволяет пользователю выбирать электроды, которые соответствуют конкретным структурам среза мозга. Этот шаг имеет решающее значение для активации правильного пути и подавления иктальной активности с помощью электрической стимуляции.
- Нажмите кнопку «Обзор», чтобы загрузить изображение среза мозга. Убедитесь, что электрод сравнения находится в верхнем ряду левой половины MEA (рисунок 2A, треугольная метка). Нажмите кнопку «Активировать указатель», затем выберите верхний и нижний электроды в крайнем левом ряду массива, чтобы отметить координаты XY для выпрямления изображения и сопоставления электродов.
- В выпадающем меню типа среза выберите По горизонтали. Установите флажок Структуры по умолчанию.
заметка: Есть возможность настроить структуры, нажав кнопку «Ввести новые структуры». Стандартные структуры для горизонтального среза мозга изображены на рисунке 2A.
- Используя пронумерованные кнопки под изображением среза мозга, выберите электроды, соответствующие ROI, и нажмите соответствующую кнопку на панели структур, чтобы назначить их (рисунок 2B); повторите этот шаг для каждого ROI.
- Нажмите кнопку «Сохранить»: программа сгенерирует папку с результатами с именем #EXP_LabelledElectrodes, содержащую таблицу с данными о выбранных электродах и ROI.
3. Регистрация и электрическая модуляция эпилептиформной активности
- Дайте срезу мозга стабилизироваться в камере записи в течение 5-10 минут перед записью.
- Включите блок стимула не менее чем за 10 минут до начала сеанса сеанса стимуляции, чтобы обеспечить самокалибровку и стабилизацию. Запустите программное обеспечение для управления стимулами и убедитесь, что стимулятор и усилитель MEA правильно подключены, на что указывает зеленый светодиод на главной панели программного обеспечения для управления стимулами.
- Настройте стимуляцию в биполярной конфигурации. Выберите пары электродов, соприкасающиеся с пирамидальным ячеистым слоем CA1/проксимального субикулума (см. 24,25) среди тех, которые картируются с помощью скрипта mapMEA (см. раздел 12). С помощью провода подключите один из выбранных электродов к отрицательной пробке стимулятора, а другой электрод — к положительной пробке того же канала стимулятора. С помощью другого провода подключите заземление стимулятора к заземлению усилителя.
- Запустите программу для записи. Чтобы получить данные, нажмите кнопку PLAY на главной панели программного обеспечения для записи. Запишите не менее 4 иктальных разрядов.<бр/>
заметка: Частота дискретизации 2 кГц позволяет получать потенциалы поля с достаточным разрешением, минимизируя при этом использование места на жестком диске. Файл записи за 5 минут занимает ~80 МБ. Может потребоваться более высокая частота дискретизации, например, для регистрации артефактов стимула или мультиюнитной активности. Чтобы наблюдать только потенциалы поля, используйте динамический фильтр нижних частот с частотой 300 Гц, чтобы отсечь активность нескольких единиц
.
- Определите интенсивность стимула.
- В программном обеспечении для управления стимулами используйте главную панель для расчета квадратного двухфазного положительно-отрицательного импульса тока длительностью 100 μс/фаза.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ! Для стимуляции постоянным током требуется сбалансированный импульс заряда, чтобы не повредить оборудование.
- Проведите быстрый тест ввода-вывода (I/O), чтобы определить наилучшую интенсивность стимула. Подайте импульс стимуляции, рассчитанный на шаге 3.5.1, с частотой 0,2 Гц или ниже, добавив межимпульсный интервал продолжительностью 5 с или более в соответствующей форме программного обеспечения для управления стимулами. На вкладке амплитуды импульса введите начальную амплитуду импульса 100 мкА/фаза и увеличивайте ее с шагом 50 - 100 мкА при каждой попытке до тех пор, пока стимуляция не сможет надежно вызывать интериктальные события в коре парагиппокампа (проверьте сигналы, визуализируемые записывающим программным обеспечением).
- Электрическая модуляция лимбического иктогенеза
- Запрограммируйте блок стимула для доставки интересующего вас протокола стимуляции. Используйте амплитуду стимула, определенную во время теста ввода-вывода.
заметка: Частота неудач вызванных реакций должна составлять ≤20 %.
- После прекращения стимуляции проверьте восстановление сети до состояния, предшествующего стимулированию, записав не менее 4 иктальных разрядов (как в шаге 3.4).
