Навигационное поведение личинок дрозофил в ответ на оптогенетическую стимуляцию обонятельных сенсорных нейронов

Аннотация

Источник: Clark, D. A., et al. Отслеживание поведения личинок дрозофилы в ответ на оптогенетическую стимуляцию обонятельных нейронов. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует исследование навигационного поведения личинок дрозофилы в ответ на оптогенетическую стимуляцию обонятельных сенсорных нейронов (ORNs). Личинки трансгенных дрозофил, экспрессирующие светочувствительные ионные каналы в ORN, размещаются на агарозе в поведенческой зоне. Оптогенетическая стимуляция светом открывает каналы, вызывая приток катионов, который запускает передачу сигнала в мозг, и записывается навигационное поведение.

Протокол

1. Создание поведенческой арены и подготовка оборудования для обеспечения оптогенетической стимуляции на поведенческой арене

1. Чтобы построить светоотталкивающую поведенческую арену, соорудите коробку размером 89 x 61 x 66 см³ (35" Д x 24" Ш x 26" В) из черных плексигласовых акриловых листов (толщиной 3 мм) (см. Таблицу материалов). Материалы для сборки такого ящика должны быть доступны в местных хозяйственных магазинах. Поместите эту коробку на столешницу в комнате поведения (рисунок 1A).
2. Установите монохромную камеру с универсальной последовательной шиной (USB) 3.0 с ПЗС-матрицей, оснащенную инфракрасным (ИК) длинночастотным фильтром 830 нм и объективом F1.4 C-mount 8 мм (см. Таблицу материалов), в центр потолка черного ящика. Поместите две инфракрасные светодиодные ленты (LED) (см. Таблицу материалов) на столешницу, чтобы осветить личинок в темном пространстве (рис. 1A).
3. Чтобы построить светодиодную платформу, приобретите квадратную алюминиевую пластину диаметром 22 см × 22 см (желательно окрашенную аэрозольной краской с матовым черным покрытием для устранения любых отражений). В центре пластины с помощью резака по металлу вырежьте отверстие, достаточно большое, чтобы поместиться вокруг ПЗС-камеры.
4. Накройте металлическую пластину красными светодиодными лентами (см. Таблицу материалов). Припаяйте провода светодиодной ленты последовательно и подайте провода полосы в реле оптроны, управляемое микропроцессором Raspberry Pi 2B (см. Таблицу материалов) (рис. 1B и 2).
5. Установите и настройте операционную систему на базе Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux на процессоре Raspberry Pi перед подключением реле оптроны к светодиодным лентам. Подключите источник питания для питания светодиодных лент и оптроны (рис. 2) (см. таблицу материалов). Установите светодиодную платформу вокруг ПЗС-камеры (рис. 1B).
   заметка: Операционная система Ubuntu Mate v16.04 находится в свободном доступе. Набор простых команд на основе Python может быть легко адаптирован к программным шаблонам светодиодных световых стимулов (см. файл синтаксиса).
6. Обеспечьте равномерное излучение в различных точках поведенческой арены. Измерьте абсолютное излучение на поверхности арены с помощью спектрометра и определите его как ~1,3 Вт/^м2 по всей поверхности арены.
   заметка: При такой интенсивности существенных изменений температуры в ходе экспериментов не наблюдалось. В другом исследовании использовалась более высокая интенсивность излучения ~1,9 Вт/^м2 и не наблюдалось никаких изменений температуры в ходе экспериментов.

2. Подготовка личинок дрозофилы к анализу поведения

1. Поддерживайте содержание мух на стандартном корме для мух (см. Таблицу материалов) при температуре 25 °C, относительной влажности (RH) 50-60% и цикле свет/темнота 12 часов.
2. Чтобы экспрессировать CsChrimson в одной паре ORNs, скрестите девственных самок из линии UAS-IVS-CsChrimson с самцами из линии OrX-Gal4 («X» соответствует одному из 21 генов рецептора запаха (Or) личинок, которые однозначно экспрессируются в каждой из 21 пары ORN).
   1. В качестве альтернативы, чтобы экспрессировать CsChrimson у всех 21 личиночных ORNs, скрещивайте девственных самок из линии UAS-IVS-CsChrimson с самцами из линии Orco-Gal4 («Orco» — это ко-рецептор, который экспрессируется во всех 21 ORN).
   2. В этих экспериментах используйте отдельную линейку UAS-IVS-CsChrimson в качестве контрольной.
      заметка: Перечисленные здесь запасы мух доступны в Центре фондов дрозофил в Блумингтоне (см. Таблицу материалов).
3. После того, как самцу и самке мухи в скрещивании позволят спариваться и откладывать яйца в течение 48 часов, переложите взрослых особей в свежий флакон.
   1. На поверхность пищевого флакона, содержащего яйца, добавьте 400 мкл смеси, содержащей 400 мкМ полностью транс-ретиналь (ATR), растворенный в диметилсульфоксиде (ДМСО), и 89 мМ сахарозы><, растворенной в дистиллированной воде. заметка: Малое количество сахарозы способствует личиночному питанию раствором НПВО. ATR является кофактором, необходимым для повышения экспрессии CsChrimson. ATR светочувствительна.
   2. После добавления ATR в пищевые флаконы, содержащие яйца, инкубируйте флаконы в темноте для получения дополнительных 72 г.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что в этом исследовании и двух предыдущих исследованиях не наблюдалось влияния на поведение личинок из-за кормления ATR, рекомендуется контролировать влияние кормления ATR, подвергая тестовые линии воздействию того же количества вышеуказанной смеси, которая не содержит ATR.
4. Извлечь личинки третьего возраста (~120 ч после откладки яиц) с поверхности корма для мух, поместив их в раствор сахарозы высокой плотности (15%). С помощью микропипетки P1000 отделите личинок, плавающих на поверхности раствора сахарозы, в стеклянный стакан объемом 1000 мл.
5. Промойте личинок 3–4 раза, каждый раз подменяя 800 мл свежей дистиллированной воды в стеклянном стакане. Дайте личинкам отдохнуть в течение 10 минут, прежде чем подвергать их поведенческому анализу.

3. Поведенческий анализ

1. Поддерживайте постоянную температуру (в пределах 22–25 °C) и влажность (от 50 до 60% относительной влажности) в комнате для поведения.
2. Приготовьте среду для ползания личинок, насыпав 150 мл растопленной агарозы (1,5%) в квадратную чашку Петри размером 22 см х 22 см. На каждую попытку анализа наливают по одной чашке Петри, 8–10 попыток на эксперимент. Дайте агарозе застыть и остыть в течение 1–2 часов в чашках Петри, прежде чем использовать их в поведенческом анализе.​
   1. Перенесите не более 20 подготовленных личинок третьего возраста в центр чашки Петри (рисунок 1В). Накройте чашку Петри крышкой. Поместите чашку Петри на поведенческую арену под ПЗС-камерой.
      заметка: В зависимости от эксперимента поведенческие анализы обычно проводят в течение 3–5 минут. Если в анализе используется одорант для предоставления ориентировочных сигналов, то было замечено, что результирующий градиент запаха остается стабильным в течение примерно 5 минут. Более длительное время анализа не рекомендуется. Вредное воздействие на личинок из-за обезвоживания или длительного воздействия красного света на длине волны 630 нм в эти временные моменты не наблюдалось.
3. Включите инфракрасный светодиодный источник света с длиной волны волны 850 нм для визуализации личинок на видео. Запустите ПЗС-камеру, чтобы зафиксировать движение личинок.
4. Используя программное обеспечение, связанное с процессором Raspberry Pi, запрограммируйте процедуру для введения соответствующих паттернов стимуляции красным светом.
   заметка: Набор простых команд на основе Python может быть легко адаптирован к программным шаблонам светодиодных световых стимулов (см. файл синтаксиса).

Результаты

Рисунок 1: Поведенческая арена и среда для ползания личинок. (А) Вид спереди на арену поведения черного ящика. Через открытую дверь арены видна ПЗС-камера, подвешенная к потолку ложи. (B) Вид снизу на металлическую платформу, содержащую красные светодиодные полосы, используемые для оптогенетической стимуляции, установлена вокруг ПЗС-камеры. (C) Вид сверху на личиночн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Видеокамера для фиксации движения личинок
ПЗС-камера	Эдмунд Оптикс	106215
Адаптер с фильтрующей резьбой M52 на M55	Эдмунд Оптикс	59-446
2-дюймовый держатель фильтра с квадратной резьбой для линз для визуализации	Эдмунд Оптикс	59-445
RG-715, 2-дюймовый квадратный фильтр дальнего пропускания	Эдмунд Оптикс	46-066
Электроника для оптогенетической установки
Малина Пи 2В	RASPBERRY-PI.org	RPI2-MODB-V1.2
3-канальный программируемый источник питания	newegg.com	9СИА3К62037092
8-канальное реле оптроны	amazon.com	6454319
Четырехрядные светодиодные ленты 630 нм	environmentallights.com	red3528-450-барабанный
Светодиодные ленты 850 нм	environmentallights.com	wp-4000K-CC5050-60x2-комплект
программное обеспечение
Ubuntu MATE v16.04	Нубунту	https://github.com/yslo/nubuntu
Другие предметы
Оргстекло черный акрил	Хоум Депо	MC1184848bl
Корм от мух и другие реагенты
Корм для мух Nutrifly	Дженеси Сайентиал	Статьи 66-112
Порошок агарозы	Дженеси Сайентиал	20-102
Квадратная чашка Петри 22 см X 22 см	VWR Inc.	No 25382-327
Дмсо	Сигма-Олдрич	Д2650
сахароза	Сигма-Олдрич	84097
Все транс-ретинальные	Сигма-Олдрич	Р2500
Мух
UAS-IVS-CsChrimson	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	No 55134
Орко-Гал4	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	No 26818
ОР42А-Гал4	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	9970
Ор7а-Гал4	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	No 23907

г.