Методическая статья

МикроРНК-опосредованное ингибирование возбуждающих постсинаптических токов в срезах гиппокампа мыши

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Thalhammer, A., et al. Объединение оптогенетики с искусственными микроРНК для характеристики влияния нокдауна гена на пресинаптическую функцию в интактных нейронных цепях. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует микроРНК-опосредованное ингибирование возбуждающих синаптических токов в срезах мозга гиппокампа мыши. Нейроны CA3 были инфицированы рекомбинантным вирусным вектором, содержащим конструкцию для экспрессии флуоресцентного репортера, светоактивируемый мембранный канал и микроРНК, которая подавляет экспрессию потенциал-зависимых кальциевых каналов. После помещения среза в записывающую камеру и наложения на нейрон CA1 записывающей пипеткой, световые импульсы использовались для стимуляции канала, активируемого светом, что приводило к притоку ионов и генерации потенциала действия. Отсутствие потенциал-зависимых кальциевых каналов в нейронах CA3 ингибирует высвобождение нейротрансмиттеров, вызывая ингибирование возбуждающих постсинаптических токов в синаптически связанных нейронах CA1.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Оценка роли пресинаптических белков в интактных нейронных цепях путем целенаправленной стимуляции нокаутированных нейронов с помощью оптогенетики

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол требует предварительного опыта работы с электрофизиологическими записями в острых срезах мозга и доступа к электрофизиологической установке.

  1. Стереотаксическое введение в мозг рекомбинантного аденоассоциированного вируса с мозаичными серотипами 1 и 2 (rAAV1/2). Определите стереотаксические координаты для интересующей вас области мозга с помощью стереотаксических атласов для мозга мыши или крысы.
    1. С помощью съемника микропипеток вытащите микропипетки для инъекций с длинными хвостовиками Ø 7–9 мкм; зажимите микропипетки для инъекций на хвостовике ножницами. С помощью тонкого маркера и миллиметровой бумаги нанесите калибровочные метки на микропипетки для инъекций через каждые 2 мм.
    2. Обезболить животное изофлураном и зафиксировать его в стереотаксическом аппарате.
    3. Держите животное в тепле на протяжении всей работы с помощью грелки, установленной при температуре 37 °C.
    4. Защитите глаза глазной смазкой.
    5. Сбрейте шерсть на голове с помощью электрической бритвы.
    6. Нанесите повидон-йод на бритую голову с помощью ватной палочки.
    7. Под препарирующим микроскопом сделайте разрез по средней линии.
    8. Очистите поверхность черепа ватной палочкой, чтобы сделать брегму и лямбду видимыми.
    9. Поместите микропипетку для инъекций в держатель. Прикрепите держатель к стереотаксическому кронштейну.
    10. Определите координаты x и y места инъекции относительно брегмы и/или лямбды.
    11. С помощью дрели истончите череп над целевой областью.
      заметка: Используйте мягкие круговые движения и избегайте сверления черепа, так как это может повредить поверхность мозга.
    12. Если есть кровотечение, излишки крови впитайте в себя полотенцесушительной бумагой.
      заметка: Избыток крови затруднит правильное определение координаты z.
    13. Загрузите ≤2 мкл вируса в микропипетку для инъекций капиллярным действием.
    14. Поднесите микропипетку для инъекций к координатам x и y места инъекции.
    15. Рассчитайте координату z от твердой мозговой оболочки и медленно опустите пипетку в мозг.
    16. Когда координата z будет достигнута, подождите 3 минуты, чтобы дать возможность скорректировать ткань.
    17. Применяйте низкое положительное давление с помощью шприца объемом 1 мл, подключенного через гибкую трубку к задней части микропипетки для инъекций. Визуально контролируйте скорость выброса вируса из инъекционной микропипетки через микроскоп для вскрытия и используя калибровочные метки в качестве ориентиров.
      заметка: Вирус необходимо вводить с медленной скоростью (<100 нл/мин), чтобы избежать повреждения тканей.
    18. Когда инъекция будет закончена, подождите 5 минут, отведите микропипетку для инъекции на 0,2 мм, подождите еще 5 минут, чтобы избежать обратного тока вируса.
    19. Медленно и полностью извлеките инъекционную микропипетку из мозга и утилизируйте ее в емкость, наполненную отбеливателем.
    20. Смочите череп физиологическим раствором и зашите кожу 3-4 швами.
    21. Нанесите на рану мазь с гентамицином.
    22. Поместите животное в чистую клетку с пищевыми гранулами и под тепловую лампу до полного выздоровления.
  2. Через ≥15 суток после инъекции обезглавливают животных под глубокой изофлурановой анестезией.
  3. Приготовьте острые срезы исследуемой области мозга с помощью вибратома с использованием газообразного (95% O2, 5% CO2) ледяного раствора искусственной спинномозговой жидкости (aCSF), содержащего (в мМ): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH2PO4, 1,5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 пирувата натрия и 18 глюкозы (осмолярность скорректирована до 300 мОсм). Например, если целью является анализ синаптической передачи от пирамидальных нейронов CA3 к CA1, подготовьте сагиттальные срезы формации гиппокампа (толщиной 350 мкм).
    заметка: Начиная с этого этапа, работа ведется в условиях низкой освещенности, чтобы избежать активации оптогенетического зонда под действием света окружающей среды.
  4. Дайте срезам восстановиться в течение 30 минут при 37 °C в той же aCSF в камере, предназначенной для хранения срезов мозга. Храните срезы в той же камере для среза мозга при комнатной температуре до записи.
    заметка: Используя эти условия, ломтики могут оставаться здоровыми до 6–8 часов.
  5. Перенесите один срез в погружную записывающую камеру и добавьте в него 2 мл/мин того же aCSF, используемого для восстановления, с добавлением 1,5 мМ CaCl2 (общий Ca2+: 2,5 мМ) и без пирувата натрия.
    заметка: Ломтики готовят и выдерживают в низкой концентрацииCa2+ (1 мМ) для минимизации токсичности. Запись выполняется в 2,5 мМ Ca2+ для стимулирования высвобождения везикул.
  6. Кратко проверьте сигнал выраженного флуоресцентного репортера (например, TdTomato; Рисунок 1В) для выяснения локализации и интенсивности инфекции.
  7. Заполните патч-электрод внутриклеточным раствором, содержащим (в мМ): 110 K-глюконат, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (EGTA), 3 MgCl2, 4 аденозин-5'-трифосфат магниевой соли (Mg-АТФ), 0,5 гуанозин 5'-трифосфаттринатриевой соли (Na3-GTP), 20К2-креатинфосфат, 10 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновый буфер с KOH (HEPES-KOH, pH 7,28, 290 мОм).
    заметка: Используйте патч-электрод с сопротивлением пипетки 5–6 мОм.
  8. При инфракрасном освещении достигайте плотно закрытой конфигурации целых клеток от нейрона, получающего синаптические входы от инфицированных нейронов. Например, если пирамидальные нейроны CA3 были инфицированы, патч пирамидальных нейронов в проксимальном и медиальном тракте области CA1 (рисунок 1C).
    заметка: Последовательное сопротивление можно оставить некомпенсированным, но оно должно быть постоянным и низким (≤20 МОм).
  9. Используйте фармакологию для выделения исследуемых синаптических токов. Например, если целью является исследование возбуждающей синаптической передачи, заблокируйте тормозящую синаптическую передачу с помощью 10 мкМ бикукуллина.
  10. Вызвать синаптические токи, например, возбуждающие постсинаптические токи (EPSCs), с помощью синего лазера с длиной волны 473 нм, соединенного с оптическим волокном (Ø ≤250 мкм), расположенным на соматах инфицированных нейронов (например, CA3 пирамидальные нейроны).
    1. Отрегулируйте длину стимуляции до минимума, чтобы снизить вероятность вызова более одного потенциала действия за один световой импульс. Если вы используете ChETA, установите его на 2 мс.
    2. Отрегулируйте силу стимуляции лазера для получения небольших, но четко обнаруживаемых синаптических токов (пиковая амплитуда ≤50 пА для EPSC, зарегистрированных с потенциалом удержания -70 мВ между пирамидальными нейронами CA3 и CA1; Рисунок 1D). При использовании ChETA и оптического волокна диаметром 250 мкм должна быть подходящая сила стимуляции 1–3 мВт на выходе из волокна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: если мощность лазера не может быть отрегулирована, используйте фильтры нейтральной плотности.
    3. Посветите лазерным светом с длиной волны 473 нм на соматы инфицированных нейронов, но не на их аксоны. Например, пролейте свет на сомату CA3 и подальше от коллатералей Шаффера, чтобы избежать прямой деполяризации аксонов.
    4. Нанесите на образец тетродотоксин (TTX; 0,5 мкМ), блокатор натриевых каналов, чтобы подтвердить, что каналы обусловлены потенциалом действия.
    5. В различных записях применяйте селективный блокатор к исследуемому синаптическому току, чтобы подтвердить, что стимуляция является селективной><. заметка: Например, применяйте 2,3-диоксо-6-нитро-7-сульфамоилбензо[f]хиноксалин (NBQX, 10 мкМ) к EPSC типа α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA)-типа глутаматных рецепторов.
    6. Сравните оптически и электрически вызванные синаптические токи в одном и том же остром срезе мозга в ответ на повторяющуюся стимуляцию (≥2 стимула на частоте ≤20 Гц). Аналогичная степень синаптической фасилитации или угнетения должна наблюдаться между электрической и оптической стимуляцией при использовании контрольной микроРНК (miR), что позволяет предположить, что аналогичные клеточные механизмы активируются двумя типами стимуляции><. заметка: Вышеуказанные шаги необходимы для того, чтобы оптическая стимуляция не вызывала прямой деполяризации пресинаптических бутонов, таким образом, обходя некоторые механизмы синаптической передачи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1. Оценка роли Cav2.1[EFa] и Cav2.1[EFb] в нативном гиппокампе путем целенаправленной стимуляции сбитых нейронов с помощью оптогенетики. (А) Схема экспрессионной кассеты конструкций rAAV, используемых для инфицирования in vivo. (B) Разрез гиппокампа, показывающий, что флуоресценция TdTomato ограничена областью CA3 и ее проекциям...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Срезы мозга PrechamberГарвардский аппаратБСК-ПК
Тепловизор на базе ПЗС-камерыБио-РадХемиДок™ МП
Реагенты для клеточных культурТехнологии Life
сверлоФордомК.1030
ЭГТАсигмаЕ4378
Гентамициновая мазьМестная аптека
глюкозасигмаГ7021
ХЕПЕСсигмаNo 54459
Инъекционные микропипеткиНарисигэГД1
Неорганические соли и моющие средствасигма
К-2-креатинфосфатКальбиохим237911
KGluconateФлюка60245 (Английский
лазерТехнологии лазерного свеченияЛРС-0473-ГФМ-00100-03
мембранаАмершамПротран™ 0,2 мкм НЗ
МгАТФсигмаА9187
Держатель для микропипетокНарисигэИМ-Н1
Съемник микропипетокНарисигэПК-100
Д/о3ГТПсигмаГ8877
NaPyruvateсигмаП5280
Глазная смазкаМестная аптекаЛакригель
Повидон-йодМестная аптекаБетадин
Стереотаксический аппаратВПИ
ТетродотоксинТокрис1069токсичный
ВибратомЛейкаVT1200S
) шт.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

patch clamp

Похожие статьи