$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Загрузка кальциевого красителя
- Подбирайте кальциевые красители в зависимости от предпочтений конкретного исследователя. Здесь мы используем Fluo-8AM или Fluo-4AM. Однако этот способ может быть применен и к другим красителям: растворить кальциевые красители в ДМСО до 1 мМ раствора и 1% блок-сополимеров (например, плуроновой кислоты-127) до конечного объема 50 мкл и облучать ультразвуком в течение 10 мин.
- Добавьте раствор в aCSF до конечной концентрации 10 мкМ, 0,01% блок-сополимеров для срезов мозга.
- Взрослым животным (>12 недель) пипеткой наносите красители (50 мкл) непосредственно на срезы мозга и выдерживайте в течение 75 минут, чтобы обеспечить лучшее проникновение красителя в глубокие слои.
- Чтобы обеспечить достаточное насыщение кислородом погруженного среза во время инкубации красителя, подготовьте стеклянную загрузочную камеру с закрытой крышкой (круглая банка диаметром 2,5 см, высотой 3,5 см) с кальциевыми красителями, разведенными в 2,5 мл aCSF. Непрерывно насыщать кислородом 95%O2/5% CO2. Не пузыритесь.
- После загрузки красителя промойте ткань с aCSF и перенесите ее в инкубационную систему, медленно снижая температуру до 15 - 16 °C до тех пор, пока она не будет готова к экспериментальному использованию.
2. Электрофизиологические записи и визуализация
- Поместите ткань в погружную записывающую камеру под микроскопом и перфузируйте кислородированным аКСФ со скоростью потока 4 - 5 мл/мин при RT (~22 °C) или физиологической температуре (~35 °C). Удерживайте ткань на месте с помощью изготовленной на заказ «арфы», сделанной из нейлоновых или золотых нитей, натянутых и приклеенных на U-образный кусок золотой или платиновой проволоки.
- Для электрофизиологии:
- Подготовьте записывающие пипетки из боросиликатного стекла диаметром 1,5 мм (1,19 мм) с помощью съемника микропипеток для достижения конечного сопротивления 5-6 МОм.
- Наполните пипетку 3–4 мкл внутреннего раствора и визуализируйте ячейки под действием инфракрасного дифференциального интерференционного контраста (IR-DIC) с помощью ПЗС-камеры. Внутриклеточное решение должно быть тщательно подобрано для каждого эксперимента для достижения экспериментальных результатов.
- Расположите пипетку, сохраняя положительное давление, оказываемое через всасывающее отверстие на держателе пипетки на мембране клетки с помощью микроманипулятора. Предварительное соскабливание мембраны не требуется, так как ILM была удалена из сетчатки. Как только пипетка окажется на элементе, приложите к ней мягкое отрицательное давление, чтобы добиться гигаомного уплотнения. Затем разорвите клеточную мембрану с кратковременным отрицательным давлением.
- Выполняйте записи токовых клещей или клещей напряжения для всей ячейки, используя стандартные методы, если это необходимо.
- Визуализация кальция:
- Для одной длины волны возбуждения Fluo-4 отфильтруйте возбуждающий свет через полосовой фильтр 460 - 490 нм, а излучаемый свет - через полосовой фильтр 515 - 550 нм. Используйте высокоскоростную цифровую камеру для самой быстрой и чувствительной записи. Получайте изображения по мере необходимости.
- Измеряйте изменения флуоресценции в зависимости от времени либо на одной длине волны (Fluo-4).