Тестирование моносинаптических соединений с использованием тетродотоксина и резистентных к тетродотоксину натриевых каналов

Аннотация

Источник: Zhang, X. et al., Изучение моносинаптических связей у дрозофил с использованием устойчивых к тетродотоксину натриевых каналов. J. vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует тестирование моносинаптических связей с использованием трансгенной мухи. У мухи есть устойчивые к тетродотоксину натриевые каналы и активируемые красным светом каналы в пресинаптических нейронах, которые оптогенетически возбуждаются для передачи сигналов постсинаптическим нейронам.

Протокол

1. Подготовка мух и определение линий промотора GAL4

1. Выберите линию промотора GAL4 и скрестите ее с мухами, несущими как трансген UAS-NaChBac, так и оптогенетический трансген для активации.
   заметка: UAS-CsChrimson выбран из-за его высокой проводимости и легкости, с которой он активирует потенциалы действия, опосредованные тетродотоксином (TTX)-устойчивым к натриевому каналу (NaChBac). Оба теста UAS-NaChBac и UAS-CsChrimson доступны в репозитории акций Bloomington.
2. Приготовьте полностью транс ретиналь в виде исходного раствора в этаноле (35 мМ) и храните раствор в морозильной камере при температуре -20 °С.
3. Смешайте 28 мкл этого бульона с примерно 5 мл регидратированного корма из картофельных хлопьев и добавьте эту смесь в верхнюю часть флакона с обычной средой дрозофилы.
4. Выращивайте взрослых мух, экспрессирующих csChrimson, на пище, содержащей 0,2 мМ полностью транс-ретиналь, в течение 1–3 дней.

2. Готовим запас ТТХ

1. Создать стоковый раствор 1 мМ ТТХ в дистиллированной или деионизированной воде. Храните этот раствор в лабораторном холодильнике в течение нескольких месяцев. Ознакомьтесь с политикой учреждения в отношении хранения TTX, так как многие учреждения классифицируют TTX как опасное или контролируемое вещество.

3. Подготовка мух к электрофизиологии

1. Соберите взрослых мух в возрасте 1–3 дней, выращенных на корме с полностью транс-ретиналью.
2. Поместите мух в стеклянный сцинтилляционный флакон. Поместите флакон на лед на 1 минуту, чтобы обездвижить мух.
3. С помощью грубых щипцов вставьте муху в специально изготовленную камеру для записи. Камера состоит из круга диаметром 3 1/2 дюйма, вырезанного лазером из акрила 1/16 дюйма. Вырежьте отверстие 3/4 дюйма в центре, где прикреплена специальная фольга с эпоксидной смолой, состоящей из 2 частей. Фольга содержит надежду треугольной формы, в которую вставляется муха.
4. Нанесите на животное воск или эпоксидную смолу, отверждаемую ультрафиолетом (УФ), чтобы надежно закрепить его в камере записи.
5. Подсвечивайте препарат оптическим волокном на гусиной шее для визуализации под стереомикроскопом. Установите волокна гусиной шеи для косого освещения, отрегулировав их так, чтобы они освещали ширинку прямо сбоку.
6. Отрегулируйте уровень освещенности до минимально возможного уровня, который по-прежнему позволяет четко визуализировать муху. Эта интенсивность света будет варьироваться в зависимости от эксперимента.
   заметка: Этот протокол может быть адаптирован с помощью метода экспланта мозга in situ.
7. Достаньте внешний записывающий физиологический раствор. Физиологический раствор содержит в мМ: 103 натрия хлорида, NaCl, 3 хлорида калия, KCl, 5 N-трис(гидроксиметил)метил-2-аминоэтан-сульфоновую кислоту, 8 трегалозы, 10 глюкозы, 26 бикарбоната натрия, NaHCO₃, 1 дигидрофосфата натрия,₂PO₄, 1,5 кальция хлорида, CaCl₂ и 4 хлорида магния, MgCl₂ (в дозе 270–275 мОм). Физиологический раствор пузырчат с 95% O₂/5% CO₂ (карбоген) и имеет pH 7,3.
8. Поместите 4-6 капель внеклеточного регистрирующего физиологического раствора поверх препарата от мухи. На этом этапе увеличьте уровень освещенности на диссекционном микроскопе для лучшей видимости.
9. Заточите вольфрамовую проволоку с помощью электролиза. Для изготовления провода приготовьте насыщенный раствор нитрата калия, КНО₃ и подайте примерно 20 В переменного тока (AC) при одновременном погружении наконечника провода в раствор 20 раз по 100 мс каждый до тех пор, пока наконечник не будет заточен. С помощью заточенной вольфрамовой проволоки удалите кутикулу на голове мухи и таким образом обнажите мозг.
10. Дополнительно обнажите мозг, удалив трахею и жировые тела, которые его окружают. Если у вас есть доступ к лепесткам антенны, используйте изогнутую вольфрамовую проволоку или аналогичный инструмент, чтобы аккуратно подложить антенны под камеру записи фольги для улучшения видимости. С помощью острых щипцов аккуратно оторвите глиальную оболочку, покрывающую область интереса, где будут производиться записи.
11. Перенесите записывающую камеру в электрофизиологическую установку. Немедленно приступайте к перфузии с наружной записью солевого раствора, пузырчатого с карбогеном, для сохранения мозга. Резервуар для солевого раствора размещается над столиком микроскопа и подается к препарату под действием силы тяжести. Используйте вакуумную линию и колбу Эрленмейера объемом 2 л для сбора отработанного физиологического раствора.

4. Получение записи всей клетки

1. Натяните патч-пипетки на коммерческом съемнике пипеток. Обратитесь к руководству по настройкам, чтобы получить подходящий пипетку с сопротивлением наконечника около 7 мОм.
2. Добавьте 4 мкл раствора для внутренней записи в патч-пипетку. Внутренний физиологический раствор состоит из 140 аспартата калия, 10 N-2-гидроксиэтилпиперазина-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES), 4 аденозинтрифосфата магния (MgATP), 0,5 гуанозина 5'-трифосфаттринатрия гидрата соли (Na₃GTP), 1 этиленгликоля тетрауксусной кислоты (EGTA) и 1 хлорида калия (KCl) в мМ.
3. Настройте усилитель с патч-клемом для записи всей клетки. Обнулите смещение усилителя и настройте усилитель на подачу тестовых импульсов. В данном случае используется усилитель с патч-зажимом AM Systems 2,400.
4. Надавите на пипетку и подойдите к ячейке. С помощью микроманипулятора направьте пипетку и соприкоснитесь с клеткой. Сбросьте положительное давление. Установите удерживающий потенциал мембраны на -60 мВ. Пипетка должна образовывать гигаомное уплотнение с мембраной клетки, о чем свидетельствует низкий субпикоамперный удерживающий ток.
   заметка: При использовании зеленого флуоресцентного белка (GFP), управляемого нацеливанием на клетки, постарайтесь свести к минимуму использование эпифлуоресцентного света, чтобы предотвратить активацию ChR2 и потенциальную синаптическую депрессию. Также подождите несколько минут перед применением шага 5.
5. Настройте усилитель на выдачу тестовых импульсов в диапазоне от -50 мВ до -60 мВ. Эта настройка является стандартной для усилителей с патч-зажимами. Тестовые импульсы выявят большой емкостный переходный процесс, представляющий собой ток, необходимый для зарядки патч-пипетки. Удалите емкостные переходные процессы, отрегулировав ручки компенсации емкости на усилителе AM 2400 или аналогичном усилителе.
6. Подайте короткие импульсы отрицательного давления, чтобы разорвать клеточную мембрану и получить цельную конфигурацию клетки.
   заметка: Конфигурация всей клетки наблюдается при значительном увеличении емкостных переходных процессов, показывающих емкость нейрона. Вероятно, также будет наблюдаться небольшое увеличение удерживающего тока (базового уровня). Установите усилитель в режим токовых зажимов и отрегулируйте потенциал ячейки от -50 до -60 мВ.

5. Проверьте синаптическую связь

1. Настройте систему сбора данных (DAQ) для запуска драйвера светодиодов (LED) для генерации световых импульсов. В данном случае система сбора данных National Instruments используется с Matlab для доставки аналогового сигнала на светодиодный драйвер. Интенсивность светодиода регулируется с помощью аналогового сигнала для водителя. Светодиод представляет собой светодиод с длиной волны 620-630 нм.
2. Расположите мощный красный светодиод непосредственно под препаратом. Отрегулируйте интенсивность света так, чтобы 0,238 мВт/^мм2 попадало на ширинку.
3. Активируйте пресинаптические нейроны во время записи из интересующей постсинаптической клетки. Достигайте активации клеток оптогенетически, фармакогентически или с помощью стимуляции нервов. Здесь применены csChrimson и краткие импульсы красного света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Синаптические соединения могут контролироваться либо в токовом зажиме в виде возбуждающих постсинаптических потенциалов (EPSP), либо в напряженном зажиме в виде возбуждающих постсинаптических токов (EPSC). Синаптическое соединение должно быть видно перед применением TTX в ответ на световой импульс длительностью 40 мс. Если связи не наблюдается, маловероятно, что нейроны синаптически связаны моно- или полинаптически Удерживающий потенциал может быть отрегулирован таким образом, чтобы соответственно выделять возбуждающие или тормозящие связи.
4. Если в нормальном физрастворе наблюдается соединение, добавьте TTX в систему перфузии для достижения конечной концентрации 1 мкМ. Используйте рециркуляционный насос для захвата и повторного использования физиологического раствора для сохранения TTX. Перистальтический насос будет забирать солевой раствор из ванны и возвращать его в резервуар с солевым раствором.
5. Отрегулируйте частоту вращения насоса, чтобы обеспечить сильный постоянный вакуум, который не позволяет уровню соленого раствора в ванне подниматься и падать.
   заметка: Применение ТТХ должно привести к прекращению спайковой активности в нейроне, который контролируется в целой клетке. Это подтверждает, что в солевой раствор добавлено достаточное количество ТТХ.
6. Снова подайте краткие импульсы красного света (40 мс на каждый импульс). На этом этапе любая оставшаяся синаптическая связь, скорее всего, является моносинаптической.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
UAS-csChrimson	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	No 55135	Используется в качестве нейроактиватора
UAS-NaChBac	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	9466	Возбудимость резоторов в клетках в ТТХ
Тетродотоксин	Токрис	1078	Для покупки TTX может потребоваться специальное разрешение, так как это контролируемое вещество
все транс-ретиналы	Сигма-Олдриколл транс-ретинал	Р2500	Требуется кофактор для каналродопсина
Свариваемый лист нержавеющей стали 321, толщина 0,002 дюйма, ширина 10 дюймов	Макмастер Карр	3254К7	Используется для изготовления индивидуального держателя для мух. Фольга на заказ может быть вырезана лазером в pololu.com из предоставленного PDF-файла
Диссекционный микроскоп	Цейсс	STEMI 2000-C	Используется для вскрытия препарата
моделировщик	Альмор	Ваксер Eectra 66000	Используется во время вскрытия для фиксации мухи в фольге
парафин	Джоан	4917217	Используется с восковым аппаратом
Щипцы No 5	Инструменты для точной науки	#5CO	Используется для рассечения и оголения
Ножницы для вскрытия	Инструменты для точной науки	15001-08	Используется для удаления частей кутикулы при рассечении
Вольфрамовая проволока	Системы А-М	797500	Использование при электроэпиляции для изготовления заточенных игл для препарирования
Возвратно-восстановительный перистальтический насос	Просто насосы (Amazon)	ПМ200С	для рециркуляционных ТТХ
Регулятор скорости для перистальтического насоса	Zitrades (Амазонка)	Н/Д	Контроллер затемнения ШИМ для светодиодных фонарей или ленты, 12 вольт 8 ампер, переключатель света с регулируемой яркостью, контроллер диммера DC12V 8A 96 Вт для светодиодной ленты B
Прецизионный регулятор сжатого воздуха Versa-Mount	Макмастер Карр	1804Т1	Для приложения положительного давления во время заплатки
Стеклянные капилляры	Мировые прецизионные приборы	ТВ150Ф-3	Для патч-пипеток
Многоцелевой манометр	Макмастер Карр	3846К431	Манометр для регулятора давления
Электрофизиологическая камера	Dage MTI	ИК-1000	Подойдет любая камера, которая работает в ИК диапазоне (850 нм). Вы не хотите использовать красную подсветку, так как это может активировать csChrimson
ИК светодиод	Торлабс	М850Ф2	Для косого освещения
Оптоволоконный кабель для ИК светодиодов	Торлабс	М89Л01	Пары с инфракрасным светодиодом
Объектив	Olympus 40X	LUMPlanFLN	Это может быть использовано на большинстве микросципов и хорошо работает для визуализации нейронов мухи.
Янтарный светодиод	Торлабс	М590Л3д	Для визуализации RFP и mCherry
Синий светодиод	Торлабс	М470Л3д	Для визуализации GFP
Набор фильтров GFP	Цветность	Номер 49011	Для визуализации GFP или стимулирующего канала2родопсин
Пользовательский набор фильтров mCherry	Цветность	ET580/25X и T600LPXR (из комплекта 49306), но с барьерной/эмиссионной оптикой ET610LP	Используйте только в том случае, если вы хотите запатчить идентифицированные нейроны с помощью channel2rhodopsin
Дихроичный сочетает в себе янтарный и синий светодиоды	Торлабс	DMLP550R	Используйте только пластырь под mCherry и возбуждайте канал 2rhodopsin синим светом.
Красный светодиод	СветодиодыПоддержка	Cree XPE 620 - 630 нм	Используется для управления csChrimson
Светодиодный драйвер	СветодиодыПоддержка	3021-Д-Э-1000	Используется для управления светодиодами для оптогенетической стимуляции
манипулятор	Инструменты Саттера	МП-225	Используется для позиционирования пипетки во время записи
Усилитель Patchclamp	Системы А-М	Модель 2400	Подойдет эквивалентный усилитель
Фильтр Бесселя	Уорнер Инструментс	ЛПФ 202А	Вспомогательный фильтр используется для фильтрации токовой кривой к осциллографу во время коммутации.
Система сбора данных	Национальные инструменты	NI PCIe-6321 781044-01	Используется для записи данных с усилителя на компьютер
Соединительная колодка - клемма BNC BNC-2090A	Национальные инструменты	779556-01	Используется для подключения усилителя к плате сбора данных.
Стальная фольга	Макмастер Карр	3254К7	Стальная фольга для камеры записи на заказ
Магниты	Магнетики K&J	Д42	Для крепления записывающей камеры к кольцевой стойке
1/16" Ячейка литая акриловая прозрачная	Пололу		Используется для изготовления записывающей камеры на заказ. Акрил можно вырезать лазером в pololu.com из предоставленного PDF-файла