Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Изготовление электродов для стимуляции
- Чтобы сделать один электрод для стимуляции, отрежьте шесть отрезков длиной 10 см миниатюрных соединительных проводов, снимите 2 см оболочки с одного конца и 1 см с другого.
- Скрутите два кабеля вместе и припаяйте их на более короткой зачищенной стороне.
- Приобретите полосу трехленточной упаковки любой интегральной микросхемы с корпусом SOT-353 (Small Outline Transistor-353).
- Прострочите скрученные провода через три отверстия пакета. Более длинный очищенный отрезок проводов должен находиться в полостях упаковки. Расположите кабели так, чтобы конец изоляции находился на одной линии с краем отверстий.
- Вставьте стоматологический цемент в отверстия для фиксации проводов.
осторожность: Стоматологический цемент должен быть достаточно плотным, чтобы избежать утечки в полость упаковки.
- Как только цемент затвердеет (минимум 10 минут), переверните упаковку и нанесите тонкий слой суперклея в отверстие, чтобы сформировать водонепроницаемое уплотнение по отношению к пористому цементу. Избегайте склеивания отслоившихся проводов.
- Скрутите кабели вместе на более короткой очищенной стороне и припаяйте их (рисунок 1A).
- Возьмите более длинный очищенный отрезок проводов кончиком тонкого пинцета, сверните их вокруг и оберните в полости (рисунок 1B). При необходимости обрежьте лишний кабель.
2. Изготовление записывающих электродов
- Чтобы сделать один записывающий триплетный электрод (рис. 1C-D), отрежьте кусок трубки из нержавеющей стали длиной один сантиметр с помощью высокоскоростной ротационной пилы. Снимите ребро с концов трубки острой иглой и убедитесь, что трубка чиста от мусора и полностью проницаема.
заметка: Не используйте плоскогубцы, так как они будут деформировать трубку.
- Согните позолоченный распорный штифт с минимальной длиной 3 см, чтобы сформировать J-образный держатель. Отрежьте длинную ножку формы буквы «J» и спаяйте ее вместе, чтобы вернуть исходную форму, чтобы сделать разъемное соединение между длинной линейной частью, которая будет удерживаться стереотаксическим устройством, и формой буквы «U», которая будет удерживать электрод и служить точкой крепления. Склейте трубку и более короткую ножку держателя «J» вместе. Приклейте еще несколько брусков длиной 1 см, если это необходимо, для устойчивости.
- Отрежьте 3 части электродных проводов длиной 2,5 см ультратонкими ножницами из нержавеющей стали. Убедитесь, что разрез четкий и острый, а изоляция на круглой поверхности электродного провода не повреждена. Кроме того, следите за тем, чтобы кончик среза не согнулся из-за приложенного усилия. Согните на 1 или 2 мм один конец каждого из проводов под разными углами (например, один левый прямой, один под углом 45° и один прямой), чтобы сделать их различимыми.
- Заполните трубку проводами. Выберите подходящее расстояние между электродами для эксперимента (например, для регистрации коркового локального полевого потенциала (LFP) и плотности источника тока (CSD) рекомендуемый выступ наконечников проводов из отверстия трубки составляет 4,5 мм, 4,1 мм и 3,7 мм соответственно). Обратите внимание, какой провод соответствует какой глубине, чтобы поддерживать правильный порядок каналов.
- Как только провода выровняются рядом друг с другом и станут параллельны трубке, чтобы зафиксировать электродные провода, поместите одну каплю жидкого суперклея на оба конца трубки с помощью острой иглы. Следите за тем, чтобы клей стекал внутрь тюбика за счет капиллярного эффекта, а не по направлению к местам записи на выступающих концах.
- Подготовьте плату интерфейса электродов с подходящим микроразъемом, совместимым с используемой системой регистрации.
- Введите незаписывающиеся, загнутые концы проводов в отверстия платы сопряжения электродов, соответствующие нужному каналу записи. Когда все провода встанут на свои места, вставьте золотые штифты в отверстия с помощью пинцета.
заметка: Золотые штифты могут быть зафиксированы на месте с помощью стоматологического цемента, но в большинстве случаев они достаточно стабильны и без этого шага безопасности.
3. Анестезия
- Поместите животное в герметичную анестезиологическую индукционную камеру и наполните ее 4 - 5% изофлураном в 2 л/мин медицинского воздуха.
- Когда крыса будет лежачей, извлеките животное из камеры и поместите его в стереотаксическую рамку с соответствующим вентиляционным наконечником.
- Установите уровень изофлурана на 2%, при этом скорость воздушного потока должна оставаться прежней. Проверьте уровень анестезии. Если отсутствует рефлекс отведения лапы в ответ на защемление, продолжайте, в противном случае увеличивайте глубину анестезии.
- Контролируйте и поддерживайте температуру тела крысы на уровне 37 ± 0,5 °C с помощью гомеотермической системы мониторинга. Нанесите каплю парафиновой мази на глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы. При необходимости повторите эту процедуру несколько раз во время операции.
- Подкожно вводите 0,3 мг/кг атропина, чтобы избежать образования слизи в дыхательных путях. При более длительных операциях повторяйте это каждые четыре часа. Следите за дыханием и при необходимости отрегулируйте испаритель.
4. Имплантация электродов для стимуляции и записи
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавируйте все необходимые хирургические инструменты и тщательно соблюдайте общие правила асептики и антисептики во время всей процедуры. Избегайте прикосновения к нестерильным зонам за пределами операционной зоны. Перед имплантацией погрузите электроды в этиловый спирт (70%) на 30 минут.
- Удалите большую часть волос с кожи головы с помощью машинки для стрижки волос. Нанесите крем для депиляции на кожу головы, равномерно распределите его по поверхности и подождите несколько минут. С помощью шпателя аккуратно удалите крем и оставшиеся волосы. Промойте кожу водой, затем дезинфицирующим средством.
- Введите 1 - 2% лидокаин (не превышайте общую дозу 7 мг/кг) подкожно, чтобы вызвать онемение кожи. Нанесите одну каплю ветеринарной мази для глаз (например, парафина).
- Сделайте тщательный и длинный (~2 см) сагиттальный разрез по средней линии скальпелем от лба до шеи. Рассеките ткани, в том числе надкостницу, от черепа. Затем с помощью зубила или зубного пинцета очистите область между кристами двух височных костей. Втяните рассеченную кожу с помощью четырех бульдогов, чтобы сохранить череп открытым.
- Аккуратно поместите тонкий пинцет между крутым краем височной кости и мышцами и разделите их. Делайте поджигающие движения, чтобы обнажить как можно большую поверхность височной кости, предпочтительно от края затылочной кости до плоскости коронарных швов, не повреждая мышцы.
- Расположите ретракторы в обоих направлениях, чтобы височные кости оставались открытыми.
- Промойте поверхность черепа 1 - 2 мл 3% перекиси водорода (Н2О2), затем промойте ее 1 - 2 мл воды.
- Высушите поверхность височных костей на воздухе очень осторожно, вытирая влагу глазными палочками. Проверьте, прилегают ли электроды для стимуляции к очищенной вертикальной поверхности черепа (верхний край электрода для стимуляции должен находиться на одной линии с краем кристалла височной кости). При необходимости отрегулируйте бульдогов и втягивающие устройства или придайте форму электродам стимуляции с помощью ножниц.
- Заполните полости электродов стимуляции электродами электропроводящим гелем и нанесите тонкий слой клея на ободок электродов.
- Поместите стимулирующий электрод на сухую поверхность височной кости одним точным движением и крепко удерживайте его на месте в течение одной минуты тонким пинцетом. Следите за тем, чтобы влага не контактировала с клеем. При необходимости вытереть окулярными палочками.
осторожность: Если электрод становится нестабильным, снимите его. После очистки кости повторите этот шаг с новым электродом для стимуляции.
- Нанесите стоматологический цемент на края электрода для стимуляции, непрерывно высушивая влагу из тканей с помощью глазных палочек. Затем покройте весь электрод стимуляции цементом.
- После того как цемент полностью застынет, повторите эти действия на контралатеральной стороне.
- Просверлите несколько отверстий по всему черепу для анкерных винтов. Вбейте в отверстия миниатюрные винты и нанесите на них стоматологический цемент. Используйте сверлильную головку диаметра на ~10% меньшего диаметра по сравнению с диаметром винта.
- В зависимости от цели экспериментов либо припаять разъем к концам кабелей, поместить его на поверхность и покрыть цементом, либо продолжить имплантацию записывающих электродов и оптических волокон, либо подготовить черепное окно над черепом. В последнем случае припаяйте разъемы и закрепите их на конструкции только в конце. В случае необходимости длительной одновременной записи TES и LFP вживите вышеупомянутые электродные триплеты вместо одиночных проводов.
заметка: Такая конфигурация позволяет удалять артефакты синфазной стимуляции8. Для получения подробной информации о записи имплантации электродов см. предыдущие протоколы.
- Открытые ткани обильно промойте дезинфицирующим средством. Подкожно вводят 1 - 2% лидокаин (не превышайте общую дозу 7 мг/кг).
- Очистите края раны и закройте их простыми прерывистыми швами вокруг соединителя/имплантата. Затем продезинфицируйте рану повидон-йодом.
- Введите 5 мг/кг карпрофена подкожно. При необходимости повторите это.
заметка: Можно использовать любые другие анальгетики, соответствующие требованиям, установленным местным советом по этическому разрешению.
- Приостановите анестезию, освободите амбушюры и носовой наконечник и поместите животное в послеоперационную клетку, чтобы прийти в сознание.
- Следите за тем, чтобы животное находилось под пристальным наблюдением в течение первых послеоперационных часов. Продолжайте периодически контролировать область имплантата.
заметка: Животное не следует оставлять без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Содержать животное индивидуально до тех пор, пока оно полностью не восстановится после процедуры.
