Запись синаптических токов в нервно-мышечном соединении личинок дрозофилы

Аннотация

Источник: Vasin, A., et al. Focal Macropatch Записи синаптических токов из нервно-мышечного соединения личинок дрозофилы. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует технику записи синаптических токов от синаптического бутона в нервно-мышечном соединении личинки дрозофилы. Этот метод позволяет контролировать активность одного синаптического бутона, что важно для изучения мутантных линий мух с повышенной спонтанной или асинхронной синаптической активностью.

Протокол

1. Изготовление записывающих электродов

1. Вытягивание стеклянных электродов
   1. Используйте следующий протокол для съемника микроэлектродов (см. Таблицу материалов):
      1. Строка 1: Нагрев 510 тяга - скорость 30 раз 250; Линия 2: Нагрев 490 тяга - скорость 30 раз 250.
         заметка: Единицы времени соответствуют 0,5 мс на единицу; Остальные единицы являются относительными. Величина теплоты должна быть отрегулирована для каждой нити накаливания после проведения испытания на рампу.
   2. Используйте микроскоп (35-кратное увеличение), чтобы убедиться, что внутренний диаметр вытянутого электрода находится в диапазоне 7–10 мкм (рис. 1A). Храните капилляры в плотно закрытых емкостях, чтобы предотвратить накопление пыли.
2. Противопожарная полировка
   1. Отполировать капилляры огнём (80 - 90% от максимальной теплоты сгорания за 1 - 2 с) с помощью микрокузницы (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что конечный внутренний диаметр полированного электрода составляет 5 мкм (Рисунок 1A).
3. Изгиб<бр /> ПРИМЕЧАНИЕ: Два изгиба делаются для того, чтобы расположить электрод на верхней части мышцы под объективом с большим увеличением.
   1. Используйте устройство, показанное на рисунке 1В. Закрепите электрод в манипуляторе и расположите наконечник над нитью, не касаясь ее.
   2. Установите теплоту на 60 - 70% от максимальной и нажмите на педаль микрокузницы в течение 1 - 2 с (см. Таблицу материалов), чтобы нагреть нить. С помощью L-образной иглы осторожно потяните вниз кончик электрода (увеличен рисунок 1B). Сделайте изгиб примерно под углом 90° (Рисунок 1C).
   3. Проведите электрод над пламенем горелки рукой с помощью щипцов и сделайте второй изгиб на расстоянии 7 – 10 мм от первого изгиба и под углом примерно 120^о (рисунок 1С).

2. Дополнительные подготовительные шаги

1. Приготовьте раствор гемолимфоподобного (HL3) (в мМ): 70 натрия хлорида (NaCl), 5 хлорида калия (KCl), 20 хлорида магния (MgCl₂), 10 гидрокарбоната натрия (NaHCO₃), 5 трегалозы, 115 сахарозы, 5 N-2-гидроксиэтилпиперазина-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) и 1 мМ кальция хлорида (CaCl₂); отрегулируйте рН до 7,3 - 7,4. Храните раствор в холодильнике и делайте его свежим каждую неделю.
2. Делайте стимуляцию пипеток так же, как и записывающие стеклянные пипетки, за исключением того, что нет необходимости их сгибать.
   заметка: Подготовка электродов для стимуляции подробно описана в 28 и 27. Конечный диаметр после огневой полировки должен быть в пределах 5 - 7 мкм.
3. Вставьте пипетку для стимуляции в держатель микроэлектродов, подключенный к шприцу.

3. Электрические записи возбуждающих соединительных токов (EJC)

1. запись
   1. Поместите чашку Петри с препаратом на предметный столик микроскопа (рисунок 2). Вставьте электрод сравнения в ванну.
   2. Заполните записывающий электрод раствором HL3. Под объективом 10x (см. Таблицу материалов) погрузите электрод в ванну и поместите его на мышцы 6 и 7 брюшных сегментов 2, 3 или 4 с помощью микроманипулятора (см. Таблицу материалов) (Рисунок 3 A.1 и A.2).
   3. Переключите объектив на 60x (см. Таблицу материалов). Сосредоточьтесь на интересующей области с помощью эпифлуоресцентной или DIC-оптики. Поместите кончик электрода на вершину синаптического бутона (рисунок 3 B.1-3).
   4. Очень осторожно надавите электродом на мышцу. Чрезмерное давление может повредить нервно-мышечное соединение (NMJ) или вызвать увеличение спонтанной синаптической активности. Убедитесь, что наконечник электрода не забит - если это так, замените его.
   5. Включите усилитель, аналого-цифровую плату и компьютер.
   6. Выберите режим зажима напряжения на усилителе.
   7. Запустите программное обеспечение для сбора данных и выберите режим «без разрывов».
   8. Наблюдайте за появлением миниатюрных возбуждающих соединительных токов (mEJC) на экране компьютера.
   9. Убедитесь, что амплитуда mEJC находится в диапазоне 0,2 - 0,7 нА.<бр/> заметка: Меньшие EJC указывают на дефекты записывающего электрода или на его неправильное расположение.
2. стимуляция
   1. С помощью микроманипулятора, под визуальным контролем, поместите электрод стимуляции рядом с аксоном, иннервирующим брюшные сегменты 2 - 4.
   2. Приложите отрицательное давление, потянув за поршень шприца, подключенного к держателю электрода, так, чтобы аксон был втянут внутрь электрода (Рисунок 2).
   3. Включите стимулятор. Поверните ручку на блоке изоляции (см. Таблицу материалов), чтобы установить нулевой ток, а затем плавно увеличивайте его до появления EJC (или до достижения порога).
   4. Проводить стимуляцию в надпороговом режиме, при этом ток стимуляции увеличивается примерно в два раза, по сравнению с пороговым значением для наблюдения ЕЕК.
      заметка: По нашему опыту, такая интенсивность стимуляции является оптимальной для того, чтобы избежать сбоев в потенциале действия и срабатывания потенциала воздействия. Например, если EJC появляются при токе стимуляции 0,2 мА, используйте ток 0,4 мА на протяжении всего эксперимента.

Результаты

Рисунок 1. Заключительные этапы изготовления микропипеток. (A) Наконечники электродов после вытягивания и огневой полировки. (B.1) Установка для гибки наконечника. (B.2) Область в коробке показана увеличенной справа. Электрод и нить накала закреплены таким образом, что наконечник электрода расположен немного выше провода и не соприкасается. (...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микрогорелка 1WG61	гранулятор	1WG61	Микрогорелка
Olympus BX61WI	Олимп	BX61WI	Вертикальный микроскоп
Olympus Lumplan FL N 60x	Олимп	UPLFLN 60X	Объектив для микроскопа 60X
Olympus UPlan FL N 10x	Олимп	Uplanfl N 10X	Объектив микроскопа 10X
Микроманипулятор Наришигэ	Нарисигэ	MHW-3	Трехосевой водяной гидравлический микроманипулятор
npi Electronic GmbH ELC-03XS	npi Electronic GmbH	ELC-03XS	Электрофизиологический усилитель
A.M.P.I Мастер 8	A.M.P.I.	Мастер 8	Электростимулятор
A.M.P.I Изо-Флекс	A.M.P.I.	Изо-Флекс	Изолятор стимулов
Антивибрационный стол TMC	ТМС	Тел.: 63-9090	Антивибрационный стол
Клетка TMC Faraday	ТМС	81-333-90	Клетка Фарадея
Диджидата 1322А	Аксон Инструменты	Диджидата 1322А	Диджидата
компьютер	лощина	Dell Dimension 5150	Компьютер с ОС Win XP
Держатель электродов	ВПИ	МЭН3СВ	Держатель электродов
Оптический фильтр	Омега оптический	ХФ 115-2	Фильтрующий куб для обнаружения зеленого флуоресцентного белка (GFP)
ЗАЖИМ 8	Аксон Инструменты	8.0.0.81	Программное обеспечение для записи сигналов
Квантан	Собственное программное обеспечение	- T	Программное обеспечение для обработки сигналов
Canton-S (Wildtype)	Блумингтонский фондовый центр	No 64349	Управление нахлыстовой леской
cpx SH1	Щедрый дар Джей Ти Литтлтона	- T	Комплексиновая нокаутная линия мухи с повышенным спонтанным экзоцитозом
CD8-GFP	Блумингтонский фондовый центр	5137	Нахлыстовая леска с нейрональной флуоресцентной (GFP) меткой