$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Настройка системы
- Постройте блок управления давлением.
- Соберите блок регулирования давления в соответствии с схемной схемой (рис. 1). Припаяйте необходимые детали к печатной плате (печатной плате), изготовленной в соответствии со схемой электрической цепи (рисунок 1б). Используйте стандартные резисторы, светодиоды (светоизлучающие диоды), полевые транзисторы (МОП-транзисторы) на основе металлооксидных полупроводников, конденсаторы и разъемы. Припаяйте электромагнитные клапаны к печатной плате (печатной плате). Подключите воздушный насос и датчик давления воздуха к печатной плате с помощью электрического провода.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как все необходимые детали будут доступны, блок управления давлением должен быть изготовлен примерно за 2 часа.
- Подключите плату сбора вторичных данных (DAQ).
- Подключите выходы данных с печатной платы к плате сбора данных, следуя таблице 1.
заметка: Плата сбора данных будет работать в "Несимметричном режиме". Карта портов находится в руководстве пользователя (см. Таблицу материалов).
- Подключите "AIn Pr S" к одному из каналов аналогового входа (AI), а "R-Gr" - к одному из аналоговых заземлений на дополнительной плате сбора данных.
- Подключите первичный выход усилителя к одному из каналов AI, а заземление — к аналоговому заземлению вторичной платы сбора данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный кабель BNC может быть использован для подключения первичного выхода от усилителя.
- Зачистите другой конец и подключите положительный сигнал (т.е. медный сердечник) к каналу AI, а заземление (т.е. тонкий провод вокруг сердечника) к аналоговому заземлению. Повторите этот шаг для второго канала, если используется более одного канала патчей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аналоговый вход для платы сбора данных будет настроен на последующих шагах.
- Подключите питание к выходной мощности вторичной платы сбора данных. Используйте отдельный источник питания 12 В для насоса.
- Подсоедините трубку.
- Подсоедините воздушный насос и два клапана.
- На последнем этапе используйте 3-контактный соединитель для подключения мягкой трубки от верхнего порта клапана 2 к датчику давления и держателю пипетки.
- Если используются две пипетки, добавьте еще один 3-контактный соединитель к трубке, подключенной к держателю пипетки. При наложении коммутации вручную переключайтесь между клапанами и используемыми пипетками.
- Установите Autopatcher IG.
ПРИМЕЧАНИЕ: Системные требования: Autopatcher IG был протестирован только на ПК под управлением Windows 7. Он не был проверен для других операционных систем. Описанная процедура относится именно к аппаратному обеспечению, указанному в Таблице материалов.
- Скачайте Autopatcher-IG с GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
- Установите Python (версию и адрес для скачивания см. в Таблице материалов).
- Удалите библиотеку PyQt4, набрав "pip uninstall PyQt4" в терминале командной строки.
заметка: Система использует более старую версию библиотеки PyQt4 для достижения совместимости с библиотеками Qwt и Opencv.
- Установите библиотеки Python из исторических файлов колес (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Найдите следующие файлы: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) и Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
- Чтобы установить файлы wheel, перейдите в каталог, где сохранены файлы, и введите "pip install ***wheelfilename***.whl." Замените "***wheelfilename***" на реальное имя файла.
ПРИМЕЧАНИЕ: "cp27" в имени файла wheel указывает на Python 2.7, а "win32" указывает на 32-разрядную версию Windows. Если "win32" не работает, попробуйте "win64".
- Для управления камерой с ПЗС-матрицей (устройством с зарядовой связью) загрузите и установите установщик для 64-разрядной версии (https://www.qimaging.com/support/software/). Затем скачайте MicroManager для 64-разрядной версии (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) для управления камерой в Python.
- Для управления манипуляторами и предметным столиком для микроскопа установите управляющее программное обеспечение, предоставленное производителем.
заметка: При этом также устанавливается драйвер, необходимый для управления манипуляторами. Установочный пакет обычно поставляется на компакт-диске.
- Для управления дополнительной платой сбора данных установите универсальную библиотеку с компакт-диска, предоставленного при покупке платы сбора данных.
- Настройте аппаратное обеспечение для Autopatcher IG.
- Подключите контроллеры предметного столика микроскопа и манипулятора к компьютеру через USB-порты.
- Назначьте номера COM-портов блоку 0: столику микроскопа, блоку 1: левому манипулятору и блоку 2: правому манипулятору, в указанном порядке, в файле конфигурации "ports.csv" в папке "configuration". Остальные параметры в файле ports.csv (т.е. "SCI" и "1") оставьте без изменений.
заметка: Информацию о номере COM-порта можно найти, запустив программное обеспечение для настройки манипулятора, предоставленное производителем. Перейдите на вкладку «Настройки», выберите «Настройки» и страницу «Движение», а также ознакомьтесь с метками для каждой вкладки вверху. Кроме того, эту информацию можно найти в диспетчере устройств ПК.
- Назначьте номера аналоговых входных каналов на плате сбора данных для датчика давления и патч-каналов 1 и 2 (соответствующих блокам 1 и 2). Введите номер канала в файл "DAQchannels.csv" в папке "configuration".
заметка: Рекомендуется открывать .csv файлы с помощью приложения «Блокнот», а не электронной таблицы, так как это может изменить информацию при сохранении изменений.
- Запустите Autopatcher IG.
- Включите усилитель, контроллер микроскопа и контроллер манипулятора. Убедитесь, что программное обеспечение усилителя запущено.
- Запустите Autopatcher IG с Python из терминала командной строки следующим образом: сначала измените директорию (команда "cd" для наиболее распространенных терминалов), где установлен Autopatcher IG, введите "python Autopatcher_IG.pyw" в терминале командной строки и нажмите клавишу "Enter><".
ПРИМЕЧАНИЕ: Не запускайте управляющее программное обеспечение манипулятора перед запуском Autopatcher IG, так как оно займет столик микроскопа и манипулятор, в результате чего Autopatcher IG не сможет найти оборудование. Программное обеспечение для управления манипулятором может быть запущено после полного запуска Autopatcher IG, если есть дополнительные модули, которыми необходимо управлять (например, встроенный нагреватель).
- Откалибруйте первичную пипетку.
- Вытяните патч-пипетки. Наполните стеклянную пипетку внутренним раствором и загрузите ее на ><головной стол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые стеклянные пипетки имеют разный контраст под микроскопом и могут привести к неточной калибровке.
- Переместите наконечник пипетки в поле зрения микроскопа и сфокусируйте его. Если для перемещения манипуляторов и/или предметного столика микроскопа используется циферблатная панель, обновите координаты, нажав клавишу "z" на клавиатуре.
заметка: Это действие не требуется, если для управления движением используется клавиатура (столик микроскопа: A/D - ось x, W/S - ось y, R/F - ось z; манипуляторы: H/K - ось x, U/J - ось y, O/L - ось z, 1/2 - номер единицы измерения), так как координаты будут обновляться в режиме реального времени.
- Нажмите кнопку «Начать калибровку» в главном графическом интерфейсе пользователя (GUI) для соответствующего устройства, на которое загружена пипетка (рис. 2).
заметка: Всплывающее окно появится после завершения калибровки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка будет проведена автоматически, что займет около 3,5 минут. Нажатие на ту же кнопку (теперь переключается на «отменить калибровку» после начала калибровки) прервет попытку калибровки.
- Сохраните калибровку, нажав "сохранить калибровку" в нижней части основного графического интерфейса пользователя (он сохраняет текущую калибровку для обоих манипуляторов и может быть загружен в будущем).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поле зрения при низком (4 или 10-кратном) и большом (40-кратном) увеличении должно быть выровнено для правильной работы вторичной калибровки. Пожалуйста, обратитесь к руководству пользователя используемой оптической системы для процедур юстировки.
2. Процедура автоматического зажима патча
- Готовим острые срезы мозга
- Подготовьте стеклянные пипетки для патч-зажима.
- Поместите один срез мозга в центр записывающей камеры. Стабилизируйте ломтик с помощью прижима для среза или «арфы».
- Определите флуоресцентную клетку.
- Найдите интересующую область под объективом 4X. Перемещайте предметный столик микроскопа, включив режим перемещения щелчком мыши (CTM) и щелкнув по центру интересующей области. В качестве альтернативы можно использовать клавиатуру для перемещения предметного столика микроскопа (A/D - ось X, W/S - ось Y, R/F - ось z).
- Переключитесь на объектив с большим увеличением и отрегулируйте фокусировку, перемещая микроскоп по оси z, используя R/F на клавиатуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется отрегулировать уровень водяной бани таким образом, чтобы фокальная плоскость под объективами с малым и большим увеличением была одинаковой или схожей по оси z.
- Нажмите кнопку "Detect Cell" в главном столбце графического интерфейса, "Unit 0." Если светодиодный или лазерный источник света установки не может управляться сигналом TTL, включите светодиод/лазер вручную; после завершения обнаружения ячейки появится всплывающее окно.
- При необходимости выключите светодиод/лазер, список координат ячейки появится в графическом интерфейсе «Позиции памяти». Удалите ненужные ячейки из списка, нажав кнопку "X" рядом с координатами.
- В качестве альтернативы, если целевые клетки не помечены флуоресцентной меткой, нажмите «Режим мыши» в главном графическом интерфейсе. Нажмите на интересующую ячейку; на ячейке появится желтая точка с числом, а координаты ячейки появятся в графическом интерфейсе "Позиции памяти".
- Откалибруйте вторичный пипетку.
- Заполните 1/3 стеклянной пипетки внутренним раствором. Загрузите пипетку в держатель для пипетки, прикрепленный к ведущему столику.
- Используйте объектив с малым увеличением. Подведите пипетку к полю зрения и отрегулируйте фокусировку с помощью клавиатуры (H/K - ось x, U/J - ось y, O/L - ось z). Используйте «1» и «2» для переключения между блоком 1 и блоком 2.
- Загрузите первичную калибровку, нажав на кнопку "Загрузить калибровку". Нажмите кнопку "Вторичная калибровка" в главном графическом интерфейсе под используемым устройством. Например, если используется блок 2, нажмите кнопку «Вторичная калибровка» в столбце «Блок 2». Следуйте инструкциям во всплывающем окне, чтобы переключиться на объектив с большим увеличением.
- Заплатите за целевую клетку.
- Убедитесь, что программное обеспечение "MultiClamp" (т.е. усилитель) работает. Нажмите на кнопку "Patch control", чтобы открыть графический интерфейс "Patch control"; Открытие этого графического интерфейса может занять до нескольких минут.
- Используйте объектив с 40-кратным увеличением, установив флажок "40X" в столбце "Unit 0" основного графического интерфейса. Нажмите кнопку «Перейти» рядом с интересующей ячейкой в списке координат в графическом интерфейсе «Позиция памяти»; Микроскоп переместится в клетку.
- Нажмите кнопку CTM используемого устройства в основном графическом интерфейсе, чтобы включить движение по щелчку мыши. Нажмите на интересующую ячейку; Наконечник пипетки переместится в ячейку.
- Нажмите на кнопку "Патч" в графическом интерфейсе "Управление патчами." .
заметка: Начнется автоматическая установка патчей, а давление и сопротивление можно будет контролировать в графическом интерфейсе "Patch control".
- Используйте кнопку "Unit 1 selected" для переключения входного сигнала между двумя устройствами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Система будет приближаться к целевой клетке, оказывать отрицательное давление, сопоставлять потенциал клеточной мембраны и обнаруживать образование гигауплотнения на основе ряда пороговых значений давления и сопротивления и логики.
- Управляйте автоматическим процессом в любой момент, нажимая на соответствующие кнопки в графическом интерфейсе "Patch control". Например, нажмите кнопку "Патч" еще раз, чтобы отменить пробную версию патча, и нажмите на кнопку "Следующий этап", чтобы перейти к следующему шагу, независимо от порога.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всплывающее окно уведомит пользователя о том, что образовался гигапечать, и будет представлена возможность применения запа вместе с большим отрицательным давлением.
- Выберите «Да», чтобы проникнуть внутрь с помощью комбинированного удара и отсасывания. В качестве альтернативы выберите "Нет", чтобы проникнуть только с помощью всасывания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда успешное исправление целых клеток будет завершено, всплывающее окно напомнит пользователю о необходимости сохранить журнал патчей эксперимента.
- Сохраните журнал патчей эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пробная версия патчей не увенчалась успехом, всплывающее окно уведомит пользователя, и процесс установки патчей будет сброшен.
- Вернитесь к шагу 2.4 и повторите шаги с другой ячейкой.