Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление перфузионного раствора и тестовых соединений
- Приготовьте 5 л раствора Кребса: 113 мМ натрия хлорида, NaCl, 5,9 мМ хлорида калия, KCl, 1,2 мМ дигидрофосфата натрия,2PO4, 1,2 мМ сульфата магния, MgSO4, 25 мМ гидрокарбоната натрия, NaHCO3, 1,2 мМ кальция хлорида, CaCl2 и 11,5 мМ глюкозы. Насытите раствор газовой смесью 95%О2 + 5%СО2. Предварительно охладите ~500 мл насыщенного кислородом Krebs в холодильнике.
- При необходимости приготовьте аликвоты исходных исследуемых соединений (1 мМ капсаицина в этаноле и 10 мМ 5-гидрокситриптамина (5-НТ) в физрастворе). Разбавьте средство в препарате Кребса (для применения в ванне) и в физрастворе (для внутрипросветного введения) до окончательной концентрации непосредственно перед использованием.
2. Подготовка записывающего электрода
- Вытяните записывающий электрод из стандартных стеклянных трубок без внутренних нитей накаливания (внешний диаметр 1,5 мм) с помощью обычного съемника электродов. Отрегулируйте настройки съемника для нагрева и потяните так, чтобы хвостовик вытягиваемых электродов находился в диапазоне от 20 до 25 мм.
3. Сбор тканей
- Глубоко обезболить крысу пентобарбиталом натрия (80 мг/кг, в/ч).
- Обеспечивая стерильность, обнажите брюшную полость, выполнив разрез по средней линии брюшной стенки с помощью скальпеля. Отведите брыжейку и другие ткани в сторону, чтобы обнажить толстую кишку.
- Поместите животное под препарирующий микроскоп. С помощью тщательного вскрытия найдите левый тазовый ганглий (ПГ) и определите тазовые нервы (ПН) и соединяющие его поясничные спланхнические нервы (ЛСН). Разрежьте эти нервы в нескольких миллиметрах от PG.
заметка: PG находится близко к колоректальному соединению. Как правило, 3 - 4 PN из пояснично-крестцового отдела спинного мозга и LSN проецируется на PG (рис. 1).
- Разрежьте симфизную кость, чтобы обнажить прямую кишку. Удалите ткани (например, мочевой пузырь и т.д.) над толстой кишкой; будьте осторожны, чтобы оставить PG нетронутым.
- Принесите крысу в жертву путем внутривенного введения передозировки пентобарбитала. Пересеките толстую кишку примерно на 3 см выше ПГ и удалите колоректум у животного с помощью щипцов.
- Переложите колоректум в чашку Петри, наполненную предварительно охлажденным раствором Кребса. Удалите каловые массы, аккуратно промыв толстую кишку. Удалите остатки мочевого пузыря и других тканей осторожно, не нарушая ПГ.
4. Рассечение афферентных нервов толстой кишки
- Поместите толстую кишку в записывающую камеру (20 мл) и непрерывно перфузируйте ткань карбогенированным раствором Кребса. Установите скорость перфузии на уровне 15 мл/мин.
- Канюляция толстой кишки как на оральном, так и на анальном концах. Начните внутрипросветное вливание толстой кишки с физиологическим раствором со скоростью 10 мл/ч в пероральном и анальном направлении.
- Найдите основную ПГ под препарирующим микроскопом. Используйте булавки от насекомых, чтобы обнажить ганглий. При тщательном вскрытии найдите тонкую ветвь нерва, выходящую из ганглия и идущую к толстой кишке (Рисунок 1). Перережьте нерв рядом с ганглием.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показана запись от ветви нерва, расположенной дистальнее ПГ. Нерв предположительно содержит смесь тазовых и поясничных спланхнических афферентных волокон. В качестве альтернативы запись может быть выполнена с PN и/или LSN проксимальнее PG.
- Включите нагревательную баню и прогрейте раствор Кребса, чтобы температура камеры поддерживалась на уровне 34 ± 0,5 °C.
5. Подготовка аспирационного электрода
- Возьмите предварительно вытянутую стеклянную пипетку (шаг 2) и осмотрите ее под препарирующим микроскопом. Сломайте кончик электрода парой щипцов так, чтобы его размер был сопоставим с диаметром регистрируемого нерва.
- Снимите фаску с кончика, расположив его ближе к более светлой расклешенной полосе.
6. Электрофизиологическая запись
- Подсоедините скошенный электрод к электрододержателю. Подсоедините шприц объемом 10 мл к боковому порту на держателе, чтобы подать отрицательное или положительное давление на электрод.
- Подключите держатель к днищу биоусилителя и установите подставку на манипулятор.
- Переместите электрод в тканевую ванну и заполните электрод раствором Кребса, применяя мягкое всасывание, пока он не соприкоснется с серебряной проволокой держателя. Поместите кончик электрода близко к отрезанному концу нерва и приложите отрицательное давление, чтобы всосать нерв в электрод. Приложите больше отрицательного давления, чтобы ~1 мм нерва втягивался в электрод и образовывал плотное уплотнение.
- Включите биоусилитель и установите фильтр на частоту 300 - 3000 Гц. Следите за сигналом на осциллографе и записывайте сигнал нерва (частота дискретизации 20 кГц) и сигнал внутрипросветного давления (частота дискретизации 100 Гц) с помощью компьютера с программным обеспечением для обработки данных спайков.
7. Тестирование афферентной чувствительности толстой кишки
- Нанесите рампу на растяжение толстой кишки, закрыв трехсторонний кран на выходной канюле, непрерывно вводя ее внутрисветисто. Следите за внутрипросветным давлением, пока оно не достигнет 60 мм рт.ст., после чего откройте трехсторонний кран на дренажной канюле.
