Оценка митохондриальной функции эндотелиальных клеток сосудов головного мозга

Аннотация

Источник: Rellick, S. L. et al. Оценка биоэнергетической функции в эндотелиальных клетках сосудов головного мозга. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует оценку митохондриального функционирования эндотелиальных клеток сосудов головного мозга (CVE) с использованием анализа внеклеточного потока. Клетки CVE помещаются в планшет для культивирования клеток с внеклеточным потоком. Датчики внеклеточного потока гидратируются перед загрузкой и калибровкой в биоанализатор. Затем пластина, содержащая клетки, загружается для анализа.

Протокол

1. Посев и лечение клеток эндотелия сосудов головного мозга (CVE) на планшетах для клеточных культур

1. Затравка клеток CVE (bEnd.3 cells) на 96-луночной внеклеточной клеточной культуральной пластине: 80 мкл/лунка. Поместите планшет для культивирования клеток при температуре 37 °C в инкубатор с 5% содержанием_CO2. Примечание: 16 × 10³ ячейки на лунку достигнут 60 - 80% слияния в течение 24 ч.
2. Если клетки подвергаются воздействию химического вещества, добавьте обработку после того, как клетки прикрепятся к дну планшета (через 8 - 24 часа после посева).
   заметка: Для экспериментов по трансфекции не добавляйте антибиотики в полную питательную среду.

2. Оценка функции митохондрий с помощью биоанализатора

1. Перед началом анализа необходимо увлажнить картридж с датчиком внеклеточного потока с помощью калибранта, добавив в планшет 150 мкл раствора калибранта внеклеточного потока, и инкубировать в течение ночи при 37 °C без CO₂.
2. С помощью станции промывки пластин измените среду для культивирования клеток на среду для анализа внеклеточного потока pH 7,0. Инкубируйте клетки при 37 °C без CO₂ в течение 30 - 60 минут.
3. Готовьте рабочие растворы 8 мкМ олигомицина, 4,5 мкМ карбонилцианида 4-(трифторметокси) фенилгидразона (FCCP), 10 мкМ ротенона и 10 мкМ антимицина А в модифицированной орлиной среде Дульбекко (DMEM). Загрузите 25 мкл исходных растворов в отверстия для инъекций картриджей: порт А, олигомицин; порт B, FCCP; Порт С, ротенон и антимицин А со средой для анализа внеклеточного потока. Реализуйте протокол анализа, как описано в таблице 1.
4. Загрузите гидратированный картридж в биоанализатор и выполните калибровку, нажав кнопку «Пуск». После завершения калибровки снимите нижнюю пластину картриджа и загрузите пластину ячейки, нажав на подсказку «Выгрузить картридж». Продолжайте анализ до тех пор, пока не будут завершены все измерения.
5. Откройте файл с данными и получите значения скорости от биоанализатора. Экспортируйте данные в файл электронной таблицы.

Таблица 1. Протокол работы прибора.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клеточная линия bEnd.3	АТКС	ЦРЛ-2299	25-30 пассажей
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)	АТКС	30-2002
Фетальная бычья сыворотка	Атланта Биолакс	С12450	10% в финале
Пенициллин/Стептомицин	Гиклон	SV30010	1×100 чулок
0,25% трипсин, 0,03% раствор ЭДТА	Корнинг	25-053-КИ
Пируват натрия	Корнинг	25-000-КИ	1,0 мкМ в конечном итоге
глюкоза	сигма	КАС 50-99-7	25 мМ в финале
Олигомицин	сигма	О4876	1,0 мкМ в конечном итоге
Карбонилцианид 4-(трифторметокси) фенилгидразон (FCCP)	сигма	С2920	0,5 мкМ в конечном итоге
Ротенон	сигма	Р8875	1,0 мкМ в конечном итоге
Антимицин А	сигма	КАС 1397-94-0	1,0 мкМ в конечном итоге
Станция мойки тарелок	Бионаука о морских коньках
Биоанализатор внеклеточного потока	Бионаука о морских коньках	XFe96
Планшет для культивирования внеклеточных потоковых клеток	Бионаука о морских коньках	102416-100
Картридж внеклеточного датчика потока	Бионаука о морских коньках	102416-100
Решение для внеклеточного флюсового калибра	Бионаука о морских коньках	100840-000
Среда для анализа внеклеточного потока	Бионаука о морских коньках	102365-100	PH буферизован перед анализом