$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Посев и лечение клеток эндотелия сосудов головного мозга (CVE) на планшетах для клеточных культур
- Затравка клеток CVE (bEnd.3 cells) на 96-луночной внеклеточной клеточной культуральной пластине: 80 мкл/лунка. Поместите планшет для культивирования клеток при температуре 37 °C в инкубатор с 5% содержаниемCO2. Примечание: 16 × 103 ячейки на лунку достигнут 60 - 80% слияния в течение 24 ч.
- Если клетки подвергаются воздействию химического вещества, добавьте обработку после того, как клетки прикрепятся к дну планшета (через 8 - 24 часа после посева).
заметка: Для экспериментов по трансфекции не добавляйте антибиотики в полную питательную среду.
2. Оценка функции митохондрий с помощью биоанализатора
- Перед началом анализа необходимо увлажнить картридж с датчиком внеклеточного потока с помощью калибранта, добавив в планшет 150 мкл раствора калибранта внеклеточного потока, и инкубировать в течение ночи при 37 °C без CO2.
- С помощью станции промывки пластин измените среду для культивирования клеток на среду для анализа внеклеточного потока pH 7,0. Инкубируйте клетки при 37 °C без CO2 в течение 30 - 60 минут.
- Готовьте рабочие растворы 8 мкМ олигомицина, 4,5 мкМ карбонилцианида 4-(трифторметокси) фенилгидразона (FCCP), 10 мкМ ротенона и 10 мкМ антимицина А в модифицированной орлиной среде Дульбекко (DMEM). Загрузите 25 мкл исходных растворов в отверстия для инъекций картриджей: порт А, олигомицин; порт B, FCCP; Порт С, ротенон и антимицин А со средой для анализа внеклеточного потока. Реализуйте протокол анализа, как описано в таблице 1.
- Загрузите гидратированный картридж в биоанализатор и выполните калибровку, нажав кнопку «Пуск». После завершения калибровки снимите нижнюю пластину картриджа и загрузите пластину ячейки, нажав на подсказку «Выгрузить картридж». Продолжайте анализ до тех пор, пока не будут завершены все измерения.
- Откройте файл с данными и получите значения скорости от биоанализатора. Экспортируйте данные в файл электронной таблицы.
Таблица 1. Протокол работы прибора.
