Регистрация активности брыжеечного афферентного нерва в сегменте тощей кишки мыши ex vivo

Аннотация

Источник: Nullens, S., et al. Запись in vitro активности брыжеечных афферентных нервов в сегментах тощей кишки и толстой кишки мышей. J. vis. Exp. (2016).

Это видео показывает процесс записи электрических сигналов от брыжеечных афферентных нервов в рассеченном сегменте тощей кишки мыши для изучения влияния давления тканей и изменений движения на активность афферентного нерва.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка афферентного нерва тощей кишки

1. Провести эвтаназию подростка или взрослого грызуна, которая была одобрена до начала эксперимента местным этическим комитетом (например, терминальная седация с последующей пункцией сердца, вывих шейки матки и т. д.).
   заметка: Мы использовали вывих шейки матки для принесения животных в жертву, что привело к экспериментам без необходимости дальнейшей анестезии или послеоперационного ухода, поскольку ткани дополнительно обрабатываются in vitro.
   заметка: Было показано, что возраст ослабляет брыжеечные афферентные механосенсорные функции, поэтому мы советуем исследователям придерживаться определенной возрастной группы на протяжении всего одного эксперимента.
2. Уложите убитое лабораторное животное в положение лежа на спине и с помощью скальпеля выполните разрез по средней линии живота через кожу и мышечный слой живота, простирающийся от мечевидного отростка до лобковой кости.
3. Промывают брюшную полость холодным раствором Кребса с целью предотвращения пересыхания внутрибрюшных тканей (состав Кребса: 120,03 мМ NaCl, 6,22 мМ KCl, 1,57 мМ₂PO₄, 15,43 мМ NaHCO₃, 1,21 мМ MgSO₄, 11,52 мМ D-глюкоза и 1,52 мМ CaCl2).
4. Быстро иссеките всю тощую кишку с помощью острых ножниц, иссекая примерно 20 см тонкой кишки, начиная непосредственно дистальнее двенадцатиперстного изгиба, стараясь не повредить окружающие структуры и сохраняя неповрежденной брыжейку кишечника, которая содержит кровеносные сосуды тощей кишки и афферентные нервы.
   заметка: Для простого рассечения тощей кишки в брюшной полости не нужно использовать стереомикроскоп, так как это можно легко визуализировать невооруженным глазом.
5. Поместите вырезанную тощую кишку в ледяной раствор Кребса и держите его на льду, непрерывно насыщая раствор Кребса карбогеном (95%_О2, 5%_СО2).
6. Разрежьте тощую кишку острыми ножницами на петли длиной примерно 3 см. Наблюдайте за брыжеечным пучком, содержащим сосуды и спланхнический нерв, где-то вблизи центра соответствующей петли.
7. Промойте каждый сегмент раствором Кребса с помощью тупого катетера для удаления содержимого просвета и химуса, так как они содержат пищеварительные ферменты, которые ускоряют ухудшение состояния образца ткани in vitro.
   заметка: Следите за тем, чтобы не повредить просвет петли во время промывки, так как разрушение ворсинок приведет к высвобождению медиаторов, которые могут изменить активность афферентного нерва.
8. Определите сегмент для измерения активности афферентного нерва (например, первый сегмент тощей кишки дистально связки Трейца или дуоденогеюнальный изгиб) и поместите его в специально созданную записывающую камеру, покрытую слоем силиконового эластомера.
   заметка: Начало тощей кишки анатомически определяется как часть тонкой кишки, где связка Трейца пересекает тонкую кишку, также называемую дуоденоеюнальным изгибом.
   заметка: Накройте дно записывающей камеры тонким слоем силиконового эластомера задолго до начала эксперимента. Подготовьте этот слой эластомера в соответствии с инструкциями производителя.
9. Постоянно продавливайте камеру теплым карбогенированным раствором Кребса со скоростью 10 мл/мин и поддерживайте постоянную температуру Кребса в регистрирующей камере на уровне 34 °C.
10. Установите тощий сегмент в органную ванну таким образом, чтобы оральный конец был соединен с драйвером шприца, обеспечивающим просветный поток, а аборальный конец соединился с выходом. Слегка растяните сегмент, но следите за тем, чтобы не оказывать чрезмерного напряжения. Надежно прикрепите оба конца с помощью шелковых лигатур 4/0 к входным и выходным отверстиям.
11. Прикрепите драйвер шприца к оральному концу и перфузируйте тощий сегмент внутрипросветно раствором Кребса (не содержащим кислорода, температуры окружающей среды) со скоростью 10 мл/ч.
12. С помощью булавок от насекомых прикрепите брыжейку установленного сегмента кишечника плашмя к нижнему слою силиконового эластомера. Растяните брыжейку наружу, чтобы оптимизировать визуализацию брыжеечного пучка; Не напрягайте пучок или тощую кишку.
13. Выполните пробное растяжение рампы (см. ниже), закрыв выходное отверстие до тех пор, пока внутрипросветное давление кишечного сегмента не достигнет 60 мм рт.ст., чтобы убедиться в отсутствии утечки внутрипросветного раствора Кребса из установленного сегмента. Наблюдайте плавное повышение внутрипросветного давления без перерывов.
14. Наблюдайте небольшие сокращения сегмента (перистальтические волны) во время начальной фазы растяжения. При необходимости блокируйте перистальтическую активность, добавив в раствор Кребса 1 мкМ блокатора кальциевых каналов L-типа нифедипина.
    заметка: Добавление 1 мкМ атропина в раствор Кребса в дополнение к нифедипину полностью парализует кишечный сегмент.
15. Под стереомикроскопом начните аккуратно отслаивать жировую ткань от брыжейки, осторожно потянув за нее двумя маленькими пинцетами, стараясь не повредить сосуды и афферентный нерв, которые находятся в жировой ткани.
16. Начните с удаленного расстояния от тощей кишки и обнажите оба кровеносных сосуда в брыжеечном пучке.
17. Наблюдайте за афферентным тощим нервом между обоими сосудами в виде тонкой белой нити, заключенной в жировую ткань. Рассекайте более проксимально по направлению к тощей кишке, аккуратно отшелушивая жировую ткань с помощью пинцета, когда первоначальная идентификация обоих брыжеечных сосудов и/или афферентного нерва затруднена.
18. Рассеките тощий брыжеечный нерв сегмента на расстоянии нескольких миллиметров, удалив жировую ткань, прилегающую к нерву.
19. Пересеките нерв с помощью острых тканевых ножниц. При необходимости отклейте оставшийся жир и соединительную ткань, а также эпинейрональную оболочку, осторожно потянув за нее маленьким пинцетом.
20. С помощью микроманипулятора опустите кончик всасывающего электрода, соединенного со шприцем с поршнем, в ванну для органов, затем, манипулируя поршнем, осторожно отсасывайте немного раствора Кребса из ванны для органов так, чтобы кончик электрода был погружен в раствор Кребса (рис. 1). Убедитесь, что раствор Кребса покрывает проволочный электрод внутри всасывающего электрода.
    заметка: Используйте съемник для дозатора для подготовки аспирационного капилляра из боросиликатного стекла, содержащего проволочный электрод, перед началом эксперимента.
21. Расположите кончик отсасывающего электрода непосредственно рядом с пересеченной афферентной нервной нитью и втяните перерезанную нервную цепь в капилляр по всей его длине.
22. Переместите кончик электрода в сторону жировой ткани и аспирируйте ее в стеклянный капилляр, сильно отсасывая с помощью поршня, тем самым механически «запечатывая» нерв в капилляре от содержимого органной ванны.
23. Проверьте регистрацию активности афферентного нерва с помощью системы сбора данных, например, выполнив индуцированное нарастанием увеличение афферентного возбуждения (см. ниже). После изоляции нерва в отсасывающем электроде стабилизируйте препарат в течение 15 минут, чтобы получить устойчивое состояние спонтанной активности афферентного нерва перед проведением реальных экспериментов.
24. Чтобы выполнить растяжение рампы, растяните кишечный сегмент, закрыв выходное отверстие, что приведет к постепенному повышению давления (до 60 мм рт.ст.). Выполняйте требуемый протокол эксперимента только в том случае, если три последовательных растяжения нарастания (с 15-минутным интервалом) дают воспроизводимый многокомпонентный разряд (рис. 2).

Результаты

Иллюстрация 1: Схематический обзор специально изготовленной записывающей камеры и всасывающего электрода. Подробный обзор технической установки с установленным всасывающим электродом и записывающей камерой.

Рисунок 2: Репрезентативная трассировка in vitro запис...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хлорид натрия (NaCl)	VWR Химикаты	2,78,10,295	компаунд Кребс раствор
Хлорид калия (KCl)	Акрос органика	196770010	компаунд Кребс раствор
Дигидрофосфат натрия (NaH2PO4)	VWR Химикаты	1,06,34,61,000	компаунд Кребс раствор
Бикарбонат натрия (NaHCO3)	Мерк	1,06,32,91,000	компаунд Кребс раствор
Сульфат магния (MgSO4)	Мерк	1,05,88,61,000	компаунд Кребс раствор
Хлорид кальция (CaCl2)	Мерк	2,38,11,000	компаунд Кребс раствор
D-глюкоза	VWR Химикаты	1011175П	компаунд Кребс раствор
Дистиллированная вода			компаунд Кребс раствор
Трубки из ПВХ	Расходные материалы для научных лабораторий		Кишечный сегмент должен быть установлен на трубке из ПВХ
Силиконовые трубки	Расходные материалы для научных лабораторий		Остальная часть трубки, в идеале на силиконовой основе - легче вытесняет мусор из трубки
Шелковая нить	Пирсолл Лимитед	10Б15С220	Крепление сегмента над трубкой из ПВХ
Драйвер шприца	Гарвардский аппарат	55-2222	Внутрипросветная инфузия препарата Кребса
Бинокль - с 10-кратным увеличением в oculair	Zeiss STEMI 2000		Оптимальная визуализация для рассечения афферентного нерва
Гомеотермический блок управления одеялом	Гарвардский аппарат	507214	Обогрев камеры органа
Изготовленная на заказ органная ванна с дном, покрытым Sylgard
Программное обеспечение Spike2			Регистрация и анализ данных
Булавки от насекомых, 500 штук, нержавеющая сталь, диаметр 0,2 мм	Аустерлиц булавки от насекомых в мелочах		Расслоение афферентного нерва
Пинцет Dumont #5 inox 11см	Мировой прецизионный прибор	500341	Расслоение афферентного нерва
Ножницы, пружина, 14 см	Мировой прецизионный прибор	15905	Расслоение афферентного нерва
DB digitimer	НБ 108Т2/10		датчик давления
микроманипулятор	Нарисигэ	М-3333	3D манипуляции с аспирационным электродом
микроманипулятор	Вращающийся блок X-4		3D манипуляции с аспирационным электродом
микроманипулятор	Магнитная подставка GJ-8		3D манипуляции с аспирационным электродом
Источник света	Микроскопы Euromex Holland EK-1		Оптимальная визуализация для рассечения афферентного нерва
CED 1401 Регистрирующее устройство			Регистрация активности афферентных нервов
Шумоподавление Humbug 50/60 Гц	Квест Научные приборы		Устранение фонового шума
Инфузионный насос	Гибсон Минипульс 2		Инфузия в камеру органа, в которую вмонтирован сегмент
Держатель микроэлектродов полуячейки 1,5 мм	Мировой прецизионный прибор	МЭН2СВ	Всасывающий электрод для изоляции афферентного волокна
Капилляры из боросиликатного стекла, 300 шт; 1,5/0,84 OD/ID	Мировой прецизионный прибор	1В150-4	Капилляр для изоляции афферентного нерва