Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Приготовление раствора
- Приготовьте внеклеточный раствор S1: 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту (HEPES) буферизованный внеклеточный раствор, содержащий (в мМ) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (скорректированный с помощью NaOH); осмолярность = 300 mOsm (скорректированный с помощью глюкозы).
- Приготовьте внеклеточный раствор S2: карбоген-оксигенированный (95% O2, 5% CO2) внеклеточный раствор, содержащий (в мМ) 125 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO4, 5 бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновую кислоту (BES); pH = 7,3; осмолярность = 300 mOsm (скорректированная с глюкозой).
- Приготовьте 4% низкожелирующий раствор агарозы (S3) для заделки тканей: 4% низкожелирующую агарозу. Растворите 2 г низкожелирующей агарозы в 50 мл S1 в стеклянном лабораторном флаконе объемом 100 мл вместе с магнитной мешалкой. Чтобы растопить агарозу, поставьте бутылку на водяную баню (с плотно закрытой крышкой) при температуре 70 °C примерно на 20 минут или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным при перемешивании. Остудите и выдержите растопленную агарозу на второй водяной бане при температуре 42 °C до дальнейшего использования.
- Приготовьте внутриклеточный раствор S4: Раствор пипетки, содержащий (в мМ) 143 KCl, 2 KOH, 1 этиленгликоль тетрауксусную кислоту (EGTA), 0,3 CaCl2 (свободный Ca2+ = 110 нМ), 10 HEPES, 2 аденозин5'-трифосфат магниевой соли (MgATF), 1 гуанозин 5'-трифосфат натриевой соли (NaGTP); pH = 7,1 (скорректированный с помощью KOH); осмолярность = 290 mOsm.
- Модификация/корректировка состава S1, S2 и S4 в соответствии с индивидуальным экспериментальным планом (например, фармакологические блокаторы для изоляции определенных типов токов, активируемых напряжением).
2. Вскрытие и встраивание VNO
- Принесите животное в жертву путем кратковременного воздействия CO2 и обезглавьте острыми хирургическими ножницами. Примечание: Поскольку время от принесения животного в жертву до опускания капсулы VNO на лед имеет решающее значение, минимизируйте это время до менее чем 2 минут. Чтобы сохранить жизнеспособность тканей, встраивайте оба полностью рассекреченных VNO в агарозу менее чем за 30 минут.
- Удалите нижнюю челюсть большими хирургическими ножницами. Войдите через ротовую полость и разрежьте кости нижней челюсти и мышцы с каждой стороны отдельно.
- Оставшуюся часть головы положите вверх ногами в большую чашку Петри.
- Оттяните кожу верхней челюсти и вокруг кончика носа средними щипцами, чтобы получить лучший доступ к резцам.
- С помощью ножниц для кости отрежьте наибольшую часть резцов под углом ~45° в ростральном направлении (Рисунок 1A). Это облегчит удаление капсулы VNO из носовой полости.
заметка: Не режьте корень зуба, чтобы не повредить кончик капсулы VNO.
- Возьмитесь за жесткое верхнее нёбо в его ростральной части средними щипцами и осторожно отсоедините его от одного куска под плоским углом (рис. 1B).
заметка: Многократно прополощите ледяным S2.
- Используйте ножницы с микропружинами, чтобы вырезать костное сращение между кончиком сошника и челюстью. Вставьте кончики ножниц изогнутой частью наконечника, направленной наружу от VNO, и осторожно разрежьте кость небольшими шагами как слева, так и справа сбоку от капсулы VNO.
- Чтобы удалить капсулу VNO, с помощью ножниц с микропружинами разрежьте кость сошника в каудальной части и осторожно приподнимите кость сошника из носовой полости с помощью средних щипцов. Немедленно перенесите ВНО в маленькую чашку Петри под стереомикроскопом на пакете со льдом, где будут выполнены оставшиеся этапы рассечения.
- Промойте VNO в небольшом количестве ледяного S2, чтобы предотвратить высыхание ткани.
- Отделите хрящевые капсулы, содержащие мягкие ткани VNO, захватив заднюю часть сошниковой кости щипцами среднего размера. Расположите капсулу для дорсального обзора так, чтобы стало видно разделение между обоими VNO (рисунок 1Di).
- Используйте кончик тонких щипцов, чтобы отделить обе хрящевые капсулы VNO от центральной кости, сохраняя при этом сошниковую кость прижатой к задней части.
заметка: Используйте щипцы только на краю хрящевой капсулы и будьте очень осторожны, чтобы не проколоть хрящ, так как нежный сенсорный эпителий легко повреждается.
- После того, как два VNO разделены, начните удалять хрящ, инкапсулирующий первый VNO.
- Возьмитесь за верхний край капсулы одним тонким щипцом и отщепите хрящевую стенку, которая ранее была прикреплена к кости сошника (медиальная сторона).
- Чтобы удалить остатки хряща, поверните ВНО изогнутой боковой стороной на дно посуды и надежно прижмите хрящ с одной стороны с помощью щипцов. Осторожно переместите вторые тонкие щипцы с тыльной стороны под очень плоским углом между хрящом и VNO, чтобы ослабить связь между тканью и хрящом.
- Медленно отклейте VNO от хряща, удерживая его за каудальный кончик, чтобы не повредить сенсорный эпителий.
- После того, как VNO будет отсоединен от капсулы, обязательно удалите все оставшиеся мелкие части хряща, так как любые оставшиеся кусочки хряща отделят ткань от окружающей агарозы в процессе нарезки.
- Поместите небольшую каплю ледяного S2 на первый рассеченный VNO, чтобы предотвратить повреждение тканей. Крупный кровеносный сосуд на боковой стороне станет видимым, что указывает на то, что орган все еще цел и не был сильно поврежден во время вскрытия (Рисунок 2Aii). В случае, если кровеносный сосуд был поврежден, все равно будет целесообразно продолжить срез VNO, если общая морфология не была явно нарушена.
- Сразу рассекаем второй ВНО.
- Чтобы встроить VNO, заполните обе маленькие чашки Петри до края расплавленным S3 (хранятся на водяной бане при 42 °C; см. 1.3).
- Удерживайте VNO на более широком каудальном конце тонкими щипцами, чтобы избежать повреждения сенсорного эпителия.
- Погрузите VNO в агарозу и несколько раз переместите ее горизонтально вперед и назад, чтобы удалить с ее поверхности пленку внеклеточного раствора, а также любые пузырьки воздуха.
- Расположите VNO вертикально каудальным кончиком к дну посуды. Вместо того, чтобы зажимать VNO непосредственно щипцами, отрегулируйте ориентацию, переместив кончик щипцов в непосредственной близости от VNO.
заметка: Ориентация во время встраивания имеет решающее значение, поскольку она определяет плоскость среза и доступность сенсорных нейронов во время эксперимента.
- Поставьте посуду на пакет с гелевым льдом и подождите, пока агароза застынет.
Примечание: Не изменяйте ориентацию VNO после того, как агароза начала затвердевать, так как это приведет к отделению ткани от окружающей агарозы.
3. Корональный VNO срез ткани
- С помощью небольшого шпателя удалите агарозный блок из маленькой чашки в крышку большой чашки Петри, переверните агарозу вверх дном, оставив каудальный кончик VNO обращенным вверх.
- Разрежьте блок в пирамидальную форму с помощью хирургического скальпеля (3-4 мм на конце, 8-10 мм на дне). Будьте осторожны, чтобы не повредить внедренную ткань.
- С помощью суперклея закрепите блок в форме пирамиды к центру вибратомной пластины образца и подождите ~1 минуту, пока клей полностью высохнет.
- Перенесите пластину с образцом в камеру для нарезки и подготовьте вторую VNO, соответственно. Держите пластину со вторым образцом при температуре 4 °C до использования.
- Используйте микротом с вибрирующим лезвием со следующими настройками: толщина: 150-200 мкм; скорость: 3,5 а.е. = 0,15 мм/сек; частота: 7,5 а.е. = 75 Гц. Переложите срезы в камеру оксигенации до использования после краткого изучения морфологии среза под препарирующим микроскопом. Ломтики можно держать в течение нескольких часов.
4. Электрофизиологические записи одиночных клеток
- Для записи используется вертикальный микроскоп с неподвижным столиком, оснащенный объективами для погружения в воду, объективами Додта или инфракрасным дифференциальным интерференционным контрастом (IR-DIC) и эпифлуоресценцией, а также охлаждаемая камера с зарядовой связью (ПЗС). Для сбора данных используйте усилитель с патч-клещей, головной каскад, аналого-цифровую/цифро-аналоговую (АЦП/ЦАП) интерфейсную плату и компьютер (включая программное обеспечение для записи).
- Подготовьте запас из 10-20 патч-пипеток (4-7 МОм). Вытащите пипетки из капилляров из боросиликатного стекла (внешний диаметр 1,50 мм [OD]/внутренний диаметр 0,86 мм [ID]) с помощью съемника микропипеток и отполируйте их с помощью микрокузни.
заметка: Огневая полировка наконечников пипеток имеет решающее значение при исправлении довольно маленьких VSN. Это поможет предотвратить разрыв клеточной мембраны при приложении отрицательного давления с целью получения высокопрочного уплотнения. После полировки отверстие пипетки должно составлять примерно 1 мкм.
- Храните пипетки в банке для хранения пипеток, чтобы предотвратить повреждение и накопление пыли до использования.
- Подготовить систему перфузии путем заполнения резервуаров раствора и трубок в соответствии с экспериментальным проектом.
заметка: Полностью удалите пузырьки воздуха из трубки, так как они будут сильно мешать электрофизиологической записи.
- Отрегулируйте давление, чтобы достичь расхода ~3 мл/мин.<бр/>
заметка: Высокое давление вызовет движение среза ткани, а также прекращение электрофизиологических записей.
- Перенесите срез VNO в камеру визуализации и зафиксируйте положение среза с помощью анкера из нержавеющей стали, проволоченного синтетическими волокнами толщиной 0,1 мм (рис. 2B-C).
заметка: Не накрывайте срез ткани одной из нитей синтетического волокна, а скорее агарозой, окружающей срез.
- Перенесите камеру визуализации в систему записи и непрерывно переплавляйте срез с насыщенным кислородом S2 при комнатной температуре с помощью ванны.
- Отрегулируйте всасывающий капилляр к поверхности раствора, чтобы создать медленное всасывание для постоянного обмена раствора ванны. Отрегулируйте многоствольный «перфузионный карандаш» 8-в-1 выше и рядом с несенсорной частью среза VNO, которая содержит кровеносный сосуд (рис. 2C, 3A). Полезно будет расположить перфузионный карандаш и записывающую пипетку так, чтобы они были обращены к срезу с противоположных сторон.
- Соедините электрод сравнения и раствор ванны с помощью L-образного агарового моста (заполненного 150 мМ KCl).
- Заполните патч-пипетку раствором пипетки S4.
- Установите пипетку на патч-электрод с покрытием из хлорида серебра, подключенный к головному столику, не соскребая покрытие, и надежно прикрепите.
- Перед входом в ванну надавите небольшим положительным давлением (примерно 1 мл на пластиковый шприц объемом 10 мл) на патч-пипетку.
- Опустите пипетку в ванну с помощью микроманипуляторов достаточно далеко, чтобы можно было погрузить объектив, не задев его (Рисунок 2D).
- Контролируйте сопротивление пипетки (Rpip, в диапазоне от 4 до 7 МОм) с помощью электрофизиологического программного обеспечения, подключенного к головному столику><.
заметка: ЕслиR pip равен <4 МОм, наконечник стекла разбит. Если R pip составляет >10 МОм, скорее всего, наконечник забит и пипетку необходимо заменить.
- Визуализируйте срез VNO с помощью ПЗС-камеры с использованием инфракрасного оптимизированного дифференциального интерференционного контраста (DIC) и определите FPR-rs3-i-Venus (FPR-rs3: последовательность, связанную с рецептором формильного пептида 3) с помощью флуоресцентного освещения и соответствующего фильтрующего куба.
- Фокусируйте и нацеливайтесь на флуоресцентные или нефлуоресцентные клетки в зависимости от плана эксперимента.
- Чтобы приблизиться к телу клетки, используйте маховики для максимальной чувствительности. Из-за положительного давления небольшая вмятина на клеточной мембране сомы становится видимой, как только наконечник пипетки находится в непосредственной близости.
- Отпустите положительное давление и приложите небольшое отрицательное давление для всасывания клеточной мембраны, чтобы получить высокопрочное уплотнение (1-20 ГОм). Применяйте короткие и мягкие отсасывания, чтобы нарушить клеточную мембрану и создать конфигурацию всей клетки.
- Постоянный контроль сопротивления доступа во время эксперимента.
заметка: В анализ включаются только нейроны, демонстрирующие небольшое и стабильное сопротивление доступу (≤3%от входящего R; изменение <20% в ходе эксперимента).
