Создание целоклеточного зажима для электрофизиологической записи с вомероназальных сенсорных нейронов

Аннотация

Источник: Ackels, T., et al. Углубленный физиологический анализ определенных клеточных популяций в острых срезах тканей вомероназального органа мыши. J. Vis. Exp. (2016)

В протокольном видео описывается создание целоклеточного зажима для электрофизиологической записи из сенсорных нейронов вомероназального органа (VNO) у мышей. Корональный срез VNO с флуоресцентно мечеными сенсорными нейронами помещается в записывающую установку. Меченый нейрон патчируется записывающей пипеткой в конфигурации всей клетки для электрофизиологической записи в ответ на химические стимулы.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Приготовление раствора

1. Приготовьте внеклеточный раствор S₁: 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту (HEPES) буферизованный внеклеточный раствор, содержащий (в мМ) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES; pH = 7,3 (скорректированный с помощью NaOH); осмолярность = 300 mOsm (скорректированный с помощью глюкозы).
2. Приготовьте внеклеточный раствор S₂: карбоген-оксигенированный (95% O₂, 5% CO₂) внеклеточный раствор, содержащий (в мМ) 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgSO₄, 5 бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновую кислоту (BES); pH = 7,3; осмолярность = 300 mOsm (скорректированная с глюкозой).
3. Приготовьте 4% низкожелирующий раствор агарозы (S₃) для заделки тканей: 4% низкожелирующую агарозу. Растворите 2 г низкожелирующей агарозы в 50 мл S₁ в стеклянном лабораторном флаконе объемом 100 мл вместе с магнитной мешалкой. Чтобы растопить агарозу, поставьте бутылку на водяную баню (с плотно закрытой крышкой) при температуре 70 °C примерно на 20 минут или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным при перемешивании. Остудите и выдержите растопленную агарозу на второй водяной бане при температуре 42 °C до дальнейшего использования.
4. Приготовьте внутриклеточный раствор S₄: Раствор пипетки, содержащий (в мМ) 143 KCl, 2 KOH, 1 этиленгликоль тетрауксусную кислоту (EGTA), 0,3 CaCl2 (свободный Ca²⁺ = 110 нМ), 10 HEPES, 2 аденозин5'-трифосфат магниевой соли (MgATF), 1 гуанозин 5'-трифосфат натриевой соли (NaGTP); pH = 7,1 (скорректированный с помощью KOH); осмолярность = 290 mOsm.
5. Модификация/корректировка состава S₁, S₂ и S₄ в соответствии с индивидуальным экспериментальным планом (например, фармакологические блокаторы для изоляции определенных типов токов, активируемых напряжением).

2. Вскрытие и встраивание VNO

1. Принесите животное в жертву путем кратковременного воздействия CO₂ и обезглавьте острыми хирургическими ножницами. Примечание: Поскольку время от принесения животного в жертву до опускания капсулы VNO на лед имеет решающее значение, минимизируйте это время до менее чем 2 минут. Чтобы сохранить жизнеспособность тканей, встраивайте оба полностью рассекреченных VNO в агарозу менее чем за 30 минут.
2. Удалите нижнюю челюсть большими хирургическими ножницами. Войдите через ротовую полость и разрежьте кости нижней челюсти и мышцы с каждой стороны отдельно.
3. Оставшуюся часть головы положите вверх ногами в большую чашку Петри.
4. Оттяните кожу верхней челюсти и вокруг кончика носа средними щипцами, чтобы получить лучший доступ к резцам.
5. С помощью ножниц для кости отрежьте наибольшую часть резцов под углом ~45° в ростральном направлении (Рисунок 1A). Это облегчит удаление капсулы VNO из носовой полости.
   заметка: Не режьте корень зуба, чтобы не повредить кончик капсулы VNO.
6. Возьмитесь за жесткое верхнее нёбо в его ростральной части средними щипцами и осторожно отсоедините его от одного куска под плоским углом (рис. 1B).
   заметка: Многократно прополощите ледяным S₂.
7. Используйте ножницы с микропружинами, чтобы вырезать костное сращение между кончиком сошника и челюстью. Вставьте кончики ножниц изогнутой частью наконечника, направленной наружу от VNO, и осторожно разрежьте кость небольшими шагами как слева, так и справа сбоку от капсулы VNO.
8. Чтобы удалить капсулу VNO, с помощью ножниц с микропружинами разрежьте кость сошника в каудальной части и осторожно приподнимите кость сошника из носовой полости с помощью средних щипцов. Немедленно перенесите ВНО в маленькую чашку Петри под стереомикроскопом на пакете со льдом, где будут выполнены оставшиеся этапы рассечения.
9. Промойте VNO в небольшом количестве ледяного S₂, чтобы предотвратить высыхание ткани.
10. Отделите хрящевые капсулы, содержащие мягкие ткани VNO, захватив заднюю часть сошниковой кости щипцами среднего размера. Расположите капсулу для дорсального обзора так, чтобы стало видно разделение между обоими VNO (рисунок 1D_i).
11. Используйте кончик тонких щипцов, чтобы отделить обе хрящевые капсулы VNO от центральной кости, сохраняя при этом сошниковую кость прижатой к задней части.
    заметка: Используйте щипцы только на краю хрящевой капсулы и будьте очень осторожны, чтобы не проколоть хрящ, так как нежный сенсорный эпителий легко повреждается.
12. После того, как два VNO разделены, начните удалять хрящ, инкапсулирующий первый VNO.
13. Возьмитесь за верхний край капсулы одним тонким щипцом и отщепите хрящевую стенку, которая ранее была прикреплена к кости сошника (медиальная сторона).
14. Чтобы удалить остатки хряща, поверните ВНО изогнутой боковой стороной на дно посуды и надежно прижмите хрящ с одной стороны с помощью щипцов. Осторожно переместите вторые тонкие щипцы с тыльной стороны под очень плоским углом между хрящом и VNO, чтобы ослабить связь между тканью и хрящом.
15. Медленно отклейте VNO от хряща, удерживая его за каудальный кончик, чтобы не повредить сенсорный эпителий.
16. После того, как VNO будет отсоединен от капсулы, обязательно удалите все оставшиеся мелкие части хряща, так как любые оставшиеся кусочки хряща отделят ткань от окружающей агарозы в процессе нарезки.
17. Поместите небольшую каплю ледяного S₂ на первый рассеченный VNO, чтобы предотвратить повреждение тканей. Крупный кровеносный сосуд на боковой стороне станет видимым, что указывает на то, что орган все еще цел и не был сильно поврежден во время вскрытия (Рисунок 2A_ii). В случае, если кровеносный сосуд был поврежден, все равно будет целесообразно продолжить срез VNO, если общая морфология не была явно нарушена.
18. Сразу рассекаем второй ВНО.
19. Чтобы встроить VNO, заполните обе маленькие чашки Петри до края расплавленным S₃ (хранятся на водяной бане при 42 °C; см. 1.3).
20. Удерживайте VNO на более широком каудальном конце тонкими щипцами, чтобы избежать повреждения сенсорного эпителия.
21. Погрузите VNO в агарозу и несколько раз переместите ее горизонтально вперед и назад, чтобы удалить с ее поверхности пленку внеклеточного раствора, а также любые пузырьки воздуха.
22. Расположите VNO вертикально каудальным кончиком к дну посуды. Вместо того, чтобы зажимать VNO непосредственно щипцами, отрегулируйте ориентацию, переместив кончик щипцов в непосредственной близости от VNO.
    заметка: Ориентация во время встраивания имеет решающее значение, поскольку она определяет плоскость среза и доступность сенсорных нейронов во время эксперимента.
23. Поставьте посуду на пакет с гелевым льдом и подождите, пока агароза застынет.
    Примечание: Не изменяйте ориентацию VNO после того, как агароза начала затвердевать, так как это приведет к отделению ткани от окружающей агарозы.

3. Корональный VNO срез ткани

1. С помощью небольшого шпателя удалите агарозный блок из маленькой чашки в крышку большой чашки Петри, переверните агарозу вверх дном, оставив каудальный кончик VNO обращенным вверх.
2. Разрежьте блок в пирамидальную форму с помощью хирургического скальпеля (3-4 мм на конце, 8-10 мм на дне). Будьте осторожны, чтобы не повредить внедренную ткань.
3. С помощью суперклея закрепите блок в форме пирамиды к центру вибратомной пластины образца и подождите ~1 минуту, пока клей полностью высохнет.
4. Перенесите пластину с образцом в камеру для нарезки и подготовьте вторую VNO, соответственно. Держите пластину со вторым образцом при температуре 4 °C до использования.
5. Используйте микротом с вибрирующим лезвием со следующими настройками: толщина: 150-200 мкм; скорость: 3,5 а.е. = 0,15 мм/сек; частота: 7,5 а.е. = 75 Гц. Переложите срезы в камеру оксигенации до использования после краткого изучения морфологии среза под препарирующим микроскопом. Ломтики можно держать в течение нескольких часов.

4. Электрофизиологические записи одиночных клеток

1. Для записи используется вертикальный микроскоп с неподвижным столиком, оснащенный объективами для погружения в воду, объективами Додта или инфракрасным дифференциальным интерференционным контрастом (IR-DIC) и эпифлуоресценцией, а также охлаждаемая камера с зарядовой связью (ПЗС). Для сбора данных используйте усилитель с патч-клещей, головной каскад, аналого-цифровую/цифро-аналоговую (АЦП/ЦАП) интерфейсную плату и компьютер (включая программное обеспечение для записи).
2. Подготовьте запас из 10-20 патч-пипеток (4-7 МОм). Вытащите пипетки из капилляров из боросиликатного стекла (внешний диаметр 1,50 мм [OD]/внутренний диаметр 0,86 мм [ID]) с помощью съемника микропипеток и отполируйте их с помощью микрокузни.
   заметка: Огневая полировка наконечников пипеток имеет решающее значение при исправлении довольно маленьких VSN. Это поможет предотвратить разрыв клеточной мембраны при приложении отрицательного давления с целью получения высокопрочного уплотнения. После полировки отверстие пипетки должно составлять примерно 1 мкм.
3. Храните пипетки в банке для хранения пипеток, чтобы предотвратить повреждение и накопление пыли до использования.
4. Подготовить систему перфузии путем заполнения резервуаров раствора и трубок в соответствии с экспериментальным проектом.
   заметка: Полностью удалите пузырьки воздуха из трубки, так как они будут сильно мешать электрофизиологической записи.
5. Отрегулируйте давление, чтобы достичь расхода ~3 мл/мин.<бр/> заметка: Высокое давление вызовет движение среза ткани, а также прекращение электрофизиологических записей.
6. Перенесите срез VNO в камеру визуализации и зафиксируйте положение среза с помощью анкера из нержавеющей стали, проволоченного синтетическими волокнами толщиной 0,1 мм (рис. 2B-C).
   заметка: Не накрывайте срез ткани одной из нитей синтетического волокна, а скорее агарозой, окружающей срез.
7. Перенесите камеру визуализации в систему записи и непрерывно переплавляйте срез с насыщенным кислородом S₂ при комнатной температуре с помощью ванны.
8. Отрегулируйте всасывающий капилляр к поверхности раствора, чтобы создать медленное всасывание для постоянного обмена раствора ванны. Отрегулируйте многоствольный «перфузионный карандаш» 8-в-1 выше и рядом с несенсорной частью среза VNO, которая содержит кровеносный сосуд (рис. 2C, 3A). Полезно будет расположить перфузионный карандаш и записывающую пипетку так, чтобы они были обращены к срезу с противоположных сторон.
9. Соедините электрод сравнения и раствор ванны с помощью L-образного агарового моста (заполненного 150 мМ KCl).
10. Заполните патч-пипетку раствором пипетки S₄.
11. Установите пипетку на патч-электрод с покрытием из хлорида серебра, подключенный к головному столику, не соскребая покрытие, и надежно прикрепите.
12. Перед входом в ванну надавите небольшим положительным давлением (примерно 1 мл на пластиковый шприц объемом 10 мл) на патч-пипетку.
13. Опустите пипетку в ванну с помощью микроманипуляторов достаточно далеко, чтобы можно было погрузить объектив, не задев его (Рисунок 2D).
14. Контролируйте сопротивление пипетки (R_pip, в диапазоне от 4 до 7 МОм) с помощью электрофизиологического программного обеспечения, подключенного к головному столику><. заметка: Если_{R pip} равен <4 МОм, наконечник стекла разбит. Если _{R pip} составляет >10 МОм, скорее всего, наконечник забит и пипетку необходимо заменить.
15. Визуализируйте срез VNO с помощью ПЗС-камеры с использованием инфракрасного оптимизированного дифференциального интерференционного контраста (DIC) и определите FPR-rs3-i-Venus (FPR-rs3: последовательность, связанную с рецептором формильного пептида 3) с помощью флуоресцентного освещения и соответствующего фильтрующего куба.
16. Фокусируйте и нацеливайтесь на флуоресцентные или нефлуоресцентные клетки в зависимости от плана эксперимента.
17. Чтобы приблизиться к телу клетки, используйте маховики для максимальной чувствительности. Из-за положительного давления небольшая вмятина на клеточной мембране сомы становится видимой, как только наконечник пипетки находится в непосредственной близости.
18. Отпустите положительное давление и приложите небольшое отрицательное давление для всасывания клеточной мембраны, чтобы получить высокопрочное уплотнение (1-20 ГОм). Применяйте короткие и мягкие отсасывания, чтобы нарушить клеточную мембрану и создать конфигурацию всей клетки.
19. Постоянный контроль сопротивления доступа во время эксперимента.
    заметка: В анализ включаются только нейроны, демонстрирующие небольшое и стабильное сопротивление доступу (≤3%_{от входящего} R; изменение <20% в ходе эксперимента).

Результаты

Рисунок 1: Вскрытие VNO. (A) Вид сбоку на головке мыши, чтобы проиллюстрировать положение и угол, под которым срезаются резцы. (B) Вентральный вид, показывающий наилучшую точку для захвата и откидывания верхнего нёба (UP). (C) Вентральный вид на хрящевую капсулу (CC), в которой находится VNO и сошниковая кость (VB) после удаления нижней челюсти, резц...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
химикалии
Агароза (низкая температура желирования)	ПекЛаб	35-2030
АТФ (Mg-АТФ)	Сигма-Олдрич	А9187
Бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота (BES)	Сигма-Олдрич	В9879
Хлорид кальция	Сигма-Олдрич	С1016
Этиленгликольтетрауксусная кислота (ЭГТА)	Сигма-Олдрич	Е3889
глюкоза	Сигма-Олдрич	Г8270
ГТФ (Na-GTP)	Сигма-Олдрич	51120
(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES)	Сигма-Олдрич	Н3375
Хлорид магния	Сигма-Олдрич	М8266
Хлористый калий	Сигма-Олдрич	П9333
едкое кали	Сигма-Олдрич	No 3564
Хлорид натрия	Сигма-Олдрич	С7653
Гидрокарбонат натрия	Сигма-Олдрич	С5761
Гидроксид натрия	Сигма-Олдрич	С8045
Хирургические инструменты и расходные материалы
Большая чашка Петри, 90 мм	ВВР		обезглавливание, рассечение капсулы ВНО
Маленькая чашка Петри, 35 мм	ВВР		крышка для вскрытия ВНО, чашка для заделки в агарозу
Острые большие хирургические ножницы	Инструменты для точной науки		обезглавливание, удаление нижней челюсти
Прочные ножницы для костей	Инструменты для точной науки		резцы для резки
Щипцы средние, пинцет Дюмона #2	Инструменты для точной науки		удаление кожи и нёба
Ножницы с микропружинами, 8,5 см, изогнутые, лезвия 7 мм	Инструменты для точной науки		вырезание ВНО
Две пары тонких щипцов, пинцет Дюмона #5	Инструменты для точной науки		рассечение ВНО из хрящевой капсулы
Маленький шпатель из нержавеющей стали	Инструменты для точной науки		Работа с агарозными блоками и срезами тканей
Хирургический скальпель			резка агарозного блока пирамидальной формы
оборудование
усилитель	HEKA Elektronik	ЭПС-10
Капилляры из боросиликатного стекла (внутренний диаметр 1,50 мм/внутренний диаметр 0,86 мм)	Научная продукция
ПЗС-камера	Leica Microsystems	DFC360FX
Фильтр кубический, возбуждение: BP 450-490, подавление: LP 515	Leica Microsystems	И3
Люминесцентная лампа	Leica Microsystems	ЭЛ6000
Магнитная мешалка с подогревом	Снайдерс	No 34532
Микрокузница	Нарисигэ	МФ-830
Устройство микроманипулятора	Луигс и Нейман	СМ-5
Съемник микропипеток, вертикальный, двухступенчатый	Нарисигэ	ПК-10
микроскоп	Leica Microsystems	CSM DM 6000 SP5
Шумоподавление 50/60 Гц (HumBug)	Научный квест
объективный	Leica Microsystems	HCX APO L20x/1,00 Вт
осциллоскоп	Тектроник	TDS 1001B
Осмометр	Гонотек	Осмомат 030
Перфузионная система 8-в-1	AutoMate Scientific
pH-метр пять простых	Mettler Toledo
Банка для хранения пипеток	Мировые прецизионные приборы	Е212
Записывающая камера	Луигс и Нейман	Мини-камера для нарезки
Лезвия	Уилкинсон Сворд ГмбХ	Меч Уилкинсона Классик
Камера для хранения оксигенирующих срезов; альтернативными коммерческими камерами являются, например, BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) или предварительная камера (BSC-PC; Warner Instruments)	заказной
Стереомикроскоп	Leica Microsystems	С4Е
Интерфейс триггера	HEKA Elektronik	ТИБ-14 С
Вибратом	Leica Microsystems	VT 1000 S
Водяная баня	Меммерт	СНБ 45