Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Препараты для микроионофореза
ПРИМЕЧАНИЕ: Препараты, используемые для микроионофореза, должны иметь электрический заряд при растворении в воде. Ознакомьтесь с литературой, чтобы узнать, подходит ли интересующий препарат для этой процедуры. Здесь описана процедура применения габазина, антагониста рецептора ГАМКА.
- Отфильтруйте дистиллированную воду с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм, чтобы стерилизовать ее и убедиться в отсутствии растворенных веществ. Используя эту дистиллированную воду, приготовьте ~1 000 μл 20 мМ габазина.
- Отрегулируйте pH разбавления до 4 с помощью 0,2 мкм отфильтрованного NaOH с помощью pH-электрода с тонким наконечником.
- Хранить 100 - 200 мкл аликвот при температуре -20 ºC. Разморозить в день записи. В тот же день, прежде чем животное будет утомлено, наполните бочки (3 - 5 л) многоствольного электрода препаратами с помощью микрошприца объемом 100 мкл, снабженного гибкой пластиковой иглой.
2. Хирургия и имплантация постпоста
- Проведите эксперименты на двух самцах мышей CBA/J (Mus musculus) с массой тела 27 и 30 г.
- За несколько дней до операции потрогайте животных и позвольте им свободно исследовать камеру звукозаписи, чтобы приучить их к ней. Проводите три сеанса в день, каждый из которых длится не менее 30 минут. Это успокоит их и позволит чувствовать себя комфортно во время записи.
- Обезболите мышь смесью кетамина (50 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг), вводимых внутримышечно. Эта доза глубоко обезболивает животное в течение примерно 1 часа. При необходимости вводите дополнительные дозы в размере одной трети от начальной дозы.
- Поместите животное на одеяло с подогревом, установленное для поддержания температуры 38 ± 1 ºC, и стабилизируйте голову животного в стереотаксической рамке с помощью двух ушных планок и прикусочной планки. Будьте осторожны, чтобы не проколоть барабанную перепонку ушными планками.
- Защитите глаза, нанеся каплю офтальмологического геля.
- Побрейте кожу головы с помощью ножниц и нанесите повидон-йод для дезинфекции кожи.
- С помощью скальпеля сделайте разрез по средней линии, чтобы обнажить череп и втянуть надкостницу, охватывающую теменную и более ростральную часть затылочных костей.
- Приклейте на череп легкий дюралевый штырь (вес ~0,65 г, длина 30 мм, рис. 1А) с круглым и плоским основанием (диаметр 5 мм). Приклейте серебристую проволоку к середине оголовка, оставив его концы свободными. Серебряная проволока будет использоваться в качестве электрода сравнения для электрофизиологической записи.
- Нанесите тонкий слой светоотверждаемого клея на череп и основание головного столба. Подождите 10 секунд и поместите наконечник над ростральной областью теменных костей, по средней линии.
- Световое отверждение клея с помощью синего источника света в течение 20 секунд для эффективной прочности сцепления.
- Просверлите три отверстия вокруг и позади основания головного столба с помощью электрической дрели и небольшого сверла.
- Вставьте два винта для часов (длиной ~2 мм) в просверленные отверстия, которые будут служить дополнительными точками контакта между черепом и сценой. Винты требуют 11/2 оборотов для достижения плотного прилегания. Проверьте винты щипцами, чтобы убедиться, что они не ослаблены.
- Вставьте кончик серебряного заземляющего провода в третье отверстие, убедившись, что он контактирует с твердой мозговой оболочкой. Нанесите небольшую каплю водостойкого цианоакрилатного клея, чтобы привязать проволоку к черепу.
- Нанесите светоотверждаемый композит, чтобы усилить сцепление оголовья с черепом. Закройте основание головного столба, нижнюю часть серебряной проволоки и винты, стараясь не выступать за лямбда, чтобы обеспечить доступ во время записи. Отверждайте с помощью источника синего света.
- Втяните мышцу в задней части шеи в месте ее прикрепления к черепу. С помощью небольшого трепана (диаметром 2,35 мм) просверлите круглое окно чуть ниже лямбда-шва и латерально к средней линии, чтобы обнажить нижний колликул (IC). Подтяните покрывающую кость тонким пинцетом, когда границы ослабнут. Если возникло кровотечение, прополощите его холодным стерильным физиологическим раствором, чтобы остановить его.
- С помощью композита сделайте небольшую (~1 мм в ширину и ~1 мм в высоту) стену вокруг окна и отверждите ее светом.
- Покройте открытый череп и мышцы мазью с антибиотиком. Затем смочите открытую поверхность ИС стерильным физиологическим раствором и покройте ее вазелином, заполнив лунку, образовавшуюся после изготовления стенки вокруг окна записи.
- Вводите бупренорфин подкожно (0,03 мг/кг, разведенный в солевом растворе 1:10) в качестве обезболивающего.
- Держите животное на одеяле до тех пор, пока оно не придет в себя, и верните его в клетку, чтобы оно восстановилось после операции в течение трех дней перед сеансами записи. Размещайте животных в индивидуальной клетке для содержания крыс, чтобы соседи по клетке не вычищали желе и не касались головной стойки крышки из металлической сетки. Поместите немного обогащающих веществ в клетку, когда животное живет в одном доме. Кроме того, ежедневно меняйте опилки, чтобы предотвратить заражение, и тщательно проверяйте, правильно ли животное восстанавливается и не проявляет признаков дискомфорта. Кроме того, проверьте, не находится ли вазелин над окном записи, защищающим открытый мозг.
3. Электрофизиологическая регистрация и микроионофорез
- После выздоровления дайте животному время акклиматизироваться к регистрирующей среде и успокойте его голову. Акклиматизируйте животное, закрепив подголовник к держателю, пока мышь сидит на изготовленном на заказ мягком удерживающем устройстве из пенопласта, вырезанном по размеру его тела (Рисунок 1B). Это ограничит движения мыши и будет способствовать ее спокойствию.
- Начните с 10-минутных сеансов и постепенно увеличивайте продолжительность до 120 минут. Во время сеанса вознаграждайте животных сладкими жидкостями (сгущенным молоком, разведенным в соотношении 30:70 в воде) через определенные промежутки времени. Позже, во время сеанса записи, дайте такое же вознаграждение в начале и в конце сеанса или пока ни один нейрон не изолирован.
- Если животное возбуждено перед записью, введите мягкое седативное средство ацепромазин (2 мг/кг, внутрибрюшинно). В зависимости от интересующей нервной системы, седативное средство может повлиять на ваши результаты.
- Дайте животному свободно исследовать записывающую камеру в течение 5 - 10 минут.
- Поместите тело животного в изготовленный на заказ мягкий удерживатель из пенопласта (Рисунок 1B).
- Закрепите оголовок на держателе, прикрепленном к стереотаксической раме (рис. 1C). Это хорошее время, чтобы дать животному жидкое вознаграждение.
- Накройте тело животного хлопчатобумажным одеялом и неплотно закрепите его с помощью пластикового гемицилиндра и скотча.
- Извлеките вазелин из окна записи и промойте теплым стерильным физиологическим раствором.
- Запись нейронной активности и ионтофоретического применения габазина.
- Поместите многоствольный электрод на его держатель, управляемый микроприводом и прикрепленный к микроманипулятору.
- Соедините провода для записи с помощью небольших зажимов типа «крокодил». Подсоедините положительную клемму к концу вольфрамового электрода, а клемму заземления — к серебряному проводу, который контактирует с твердой мозговой оболочкой.
- Поместите серебряную проволоку без покрытия внутрь каждой бочки так, чтобы один конец соприкасался с раствором, а другой был доступен. Подсоедините эти концы к устройству микроионофореза, следуя инструкциям производителя.
- Перемещайте многоцилиндровый электрод до тех пор, пока наконечник не соприкоснется с поверхностью мозга. Применяйте теплый стерильный физиологический раствор, чтобы предотвратить высыхание тканей мозга. В этот момент примените удерживающий ток (-10 нА для габазина; см. литературу по конкретному препарату), чтобы избежать утечки препарата из наконечника бочки при поиске одиночной активности.
- Используйте стандартные методы для выделения внеклеточной активности одного нейрона. Получите частотную характеристику (АЧХ) нейрона, т.е. комбинацию частот и интенсивностей, способную вызвать ответную реакцию, поскольку нейрон чувствителен к этим звукам.
- Выберите две частоты (f1 и f2), которые вызывают схожую скорость и схему срабатывания. Представьте каждую из этих частот как редкий и повторяющийся стимул в парадигме чудака.
заметка: Вкратце, в чудаковатой парадигме одна частота (f1) представлена как повторяющийся стимул с высокой вероятностью возникновения, в то время как вторая (f2) представляет собой редко встречающийся девиантный стимул, случайным образом перемежающийся среди повторяющихся. Во второй чудаковатой последовательности относительные вероятности двух стимулов меняются местами.
- Высвобождайте габазин, сдвигая ток на положительные значения (10 – 20 нА). Снова получите FRA и повторите парадигму чудака под применением габазина. Поддерживать выброс до тех пор, пока не будет наблюдаться видимый эффект в темпе стрельбы; Обычно это занимает 5 - 20 минут, в зависимости от конкретного препарата, его концентрации и величины тока выброса. Повторите протокол записи для получения значений под действием препарата.
- Остановите инъекцию, вернув текущее значение к значениям удержания. Подождите, пока действие препарата смоется, отслеживая, возвращается ли FRA или реакция на чудаковатую парадигму к контрольным значениям.
заметка: Сеансы записи могут длиться 2 - 3 часа в день и должны быть прекращены раньше, если животное проявляет какие-либо признаки дискомфорта или борьбы. Дайте жидкое вознаграждение и залейте записывающую камеру вазелином.
