1. Совместное культивирование MN и астроцитов спинного мозга в многоэлектродных пластинах
- Дифференцировать и пластинировать моторные нейроны и астроциты, когда они готовы к использованию в тот же день и состарены in day in vitro (DIV) 60 для моторных нейронов и DIV 90 для астроцитов.
- Покрытие пластин MEA за день до или в день нанесения покрытия выполняется следующим образом, если вы работаете с 24-луночными пластиковыми пластинами (Таблица материалов).
- Разбавьте полиорнитин (PLO) в воде или фосфатно-солевом буфере (PBS) до 100 мкг/мл.
- Добавьте 15-20 мкл в каждую лунку (в зависимости от уровня комфорта пипетки), образуя каплю в центре лунки, охватывающую область электродов и окружающую область, но не всю лунку.
- Будьте осторожны, чтобы не повредить электроды наконечником пипетки. Соблюдайте объем от скважины к скважине, чтобы обеспечить охват одной и той же площади поверхности в каждой скважине.
- Инкубировать PLO при 37 °C в течение минимум 1 ч (предпочтительно 2 ч).
заметка: Небольшие объемы высохнут, если в пластинах не будет достаточной влажности. Добавьте воду в отсеки, окружающие колодцы, чтобы обеспечить достаточную влажность на протяжении всего процесса нанесения покрытия и записи.
- Отбирайте как можно больше PLO с помощью пластикового наконечника для микропипетки. Будьте осторожны, не прикасайтесь к электродам. Умыться 250 μЛ воды три раза. Если для промываний используется вакуумный аспиратор, не допускайте его приближения к электродной решетке. После третьего промывки удалите как можно больше воды, при необходимости используя наконечник для пипетки. Дайте поверхности высохнуть под колпаком для клеточных культур со снятой крышкой.
- Как только поверхности пластин высохнут, добавьте ламинин, разведенный до 10 мкг/мл, в PBS. Используйте 15-20 мкл для покрытия каждой электродной решетки. Добавьте воду в отсеки для влажности, установите крышку на место и верните планшет для инкубации при температуре 37 °C в течение минимум 2 часов до ночи.
- В день осаждения однократно промойте культуры моторных нейронов (МН) и астроцитов PBS и добавьте трипсин 0,05% при 37 °C для лифтинга клеток (5 мин). Соберите в коническую пробирку объемом 15 мл с ингибитором трипсина и промойте планшеты со средой или основанием, чтобы убедиться, что все клетки собраны. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут и повторно суспендируйте с помощью пипетки объемом 1000 мкл для получения 1 мл суспензии для одной клетки. При повторной суспендии MN и астроцитов следует перейти на среду для совместного культивирования (табл. 1) с добавлением 20 мкМ Rho-ассоциированного ингибитора серин-треонинкиназы (ROCK-I).
- Подсчитайте МН и астроциты параллельно с помощью гемоцитометра. Во время подсчета и расчетов укупорьте суспензии элементов и поместите их в штатив из пенополистирола при температуре 4 °C.
- Рассчитайте объем, необходимый для ресуспендирования культур до концентрации 5 x 104 клеток на 5 мкл для моторных нейронов и 2,5 x 104 клеток на 5 мкл для астроцитов. Центрифугируйте суспензию клеток объемом 1 мл при давлении 300 х г в течение 5 мин и повторно суспендируйте в рассчитанном объеме.
- Рассчитайте желаемое количество лунок, которые необходимо засеять, и умножьте его на 5 мкл каждой клеточной суспензии. Смешайте необходимый объем суспензий нейронов и астроцитов в соотношении 1:1 и перемешайте пипетированием до полного смешивания (обычно дважды), но избегайте слишком агрессивных действий.
- Удалите ламинин из каждой лунки планшета MEA с помощью наконечника для дозатора. Перенесите 10 мкл готовой комбинированной клеточной суспензии в каждую лунку, образуя небольшую каплю, покрывающую электродную решетку, чтобы обеспечить плотность клеток 5 x 104 MN и 2,5 x 104 астроцитов на лунку.
заметка: Высокая плотность клеток в комбинированной суспензии требует частой повторной суспензии в промежутках между лунками на этапе посева для обеспечения точного и стабильного подсчета клеток.
- Верните тарелки в инкубатор на 20-30 мин. Следите за тем, чтобы не потревожить каплю клеток и позволить клеткам сформировать первоначальные прикрепления на пластинах.
- Через 20-30 минут добавьте теплую среду для совместной культуры + ROCK-I в каждую лунку, пипетируя 250 мкл вниз по стенке каждой лунки, а затем еще 250 мкл вниз по стенке той же лунки на противоположной стороне. Верните тарелку в инкубатор.
- Осмотрите пластины на следующий день после посева (День 1 совместной культуры). Если имеется значительное количество клеточного мусора или мертвых клеток, замените среду на свежую среду для совместного культивирования, содержащую ROCK-I. В противном случае смените среду на второй день после посева (Co-Culture Day 2) на среду для совместной культуры без ROCK-I. Выполняйте полусредние замены (аспирируйте 50% и добавляйте 60% от конечного объема с учетом испарения) два раза в неделю.
- При использовании систем MEA с однолуночными стеклянными пластинами диаметром 30 мм (Таблица материалов) подготовка пластины может занять 2 и более дней. Для этого выполните следующие действия.
- Поднимите клетки и клеточный мусор из предыдущих культур МЭА с 0,05% трипсином в течение 5-15 минут.
- Отсадите трипсин и трижды смойте водой.
- Простерилизовать, добавив 70% этанола, и выдерживать в вытяжке в течение 10 мин. Отсадить этанол, а затем трижды промыть водой.
- Нанесите 1% анионное моющее средство с ферментом протеазой в воду. Накройте пластины крышкой и оберните термопластичной пленкой и алюминиевой фольгой, а затем оставьте их на коромысле при комнатной температуре на ночь.
- Отсадите моющее средство, а затем трижды смойте водой.
- Если планируете хранить тарелки, добавьте достаточный объем воды. Накройте тарелки крышкой и оберните их термопластичной пленкой и алюминиевой фольгой и оставьте в холодильнике до следующего использования.
- Если вы планируете наносить покрытие, дайте поверхности высохнуть под колпаком для клеточных культур.
- Если требуется дополнительная стерилизация (например, предыдущая инфекция или недавнее использование), только на этом этапе подвергайте пластины MEA воздействию ультрафиолетового (УФ) света под капотом в течение 30-60 мин.<бр/>
заметка: Избегание частого воздействия ультрафиолетового излучения предотвратит повреждение электродов. Использование ультрафиолетового излучения, когда на пластинах есть сыворотка, приведет к неработоспособности электродов, поэтому его следует использовать только на очищенных пластинах.
- Когда пластины полностью высохнут, продолжайте плазменную очистку в течение 1 минуты, чтобы зарядить стеклянную поверхность пластин MEA и повысить эффективность покрытия. Плазменная очистка проводится не реже одного раза в 4-5 циклов очистки пластин MEA.
- В качестве альтернативы, когда очистка плазмы невозможна или не оправдана, добавьте достаточное количество среды, содержащей бычью сыворотку плода (FBS), чтобы покрыть поверхность планшетов MEA, и верните их в инкубатор на ночь.
- Используйте покрытие PLO (полиорнитин)/ламинин. Добавьте раствор PLO (100 мкг в PBS) сразу после очистки или аспирации плазмы и промывки FBS-содержащей среды.
- Наложите клетки, как указано выше, со следующей плотностью: 1 x 105 человеческих плюрипотентных стволовых клеток, полученных из астроцитов (hiPSC-A) / планшет и 5x 10 5 человеческих плюрипотентных моторных нейронов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC-MN) / планшет.
2. Запись с помощью многоэлектродной матрицы
- Извлекайте исходные данные о напряжении с частотой дискретизации 12,5 кГц с помощью фильтра Баттерворта с фильтром высоких частот 200 Гц и фильтром низких частот 3 кГц. Задайте распознавание пиков в виде мгновенных временных точек напряжений ≥6 стандартных отклонений от базового уровня. Определите всплески как активность с >5 пиками за 100 мс. Определите сетевую активность, когда более 35% от общего числа активных электродов срабатывают в течение 100 мс с минимум 50 пиками за один сетевой всплеск.
- Начните запись как можно скорее после Дня совместной культуры (CC) 1.
заметка: Электрическая активность будет редко отмечаться до 3-го дня КК.
- Планшеты параллельны культурам с одинаковой плотностью и реплицируются в соответствующих культуральных планшетах или покровных стеклах для биохимических анализов, иммуноцитохимии (ИКХ) или количественной ПЦР (кПЦР).
- Выполняйте запись при температуре 37 °C иCO2 на уровне 5%. Перенесите пластины в аппарат и дайте им сбалансироваться в течение как минимум 5 минут перед записью.
- Записывайте исходную активность через день или еженедельно, в течение 1-15 минут в зависимости от плана эксперимента. Не записывайте в течение как минимум 1 часа после обмена носителями, а в идеале ждите 24 часа после каждого обмена медиа.
- Для предотвращения контаминации смените среду (т.е. замените полусреду, как в шаге 1.14) после любой записи, при которой крышка стерильного планшета должна быть открыта за пределами стерильного колпака (т.е. применения лекарственных соединений). Выполняйте полную замену среды и промывание для вымывания лекарств, если пластины будут продолжать использоваться после медикаментозного лечения.
- Для целей анализа используйте не менее трех технических и биологических репликатов для каждого состояния. Экспрессируйте электрофизиологические данные с помощью n ≥ 3 репликации.
