Регистрация электрофизиологической активности нейронной сети в сокультуре нейронов и астроцитов

Аннотация

Источник: Taga, A., et al. Создание электрофизиологической платформы для моделирования БАС с помощью астроцитов и нейронов, полученных из регионально-специфических плюрипотентных стволовых клеток человека. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует создание совместной культуры нейронов и астроцитов для записи активности нейронной сети. После установления совместного культивирования моторных нейронов и астроцитов на пластине с многоэлектродной матрицей (МЭА) синхронная ритмическая электрическая активность нейронной сети регистрировалась внеклеточно с использованием МЭА.

Протокол

1. Совместное культивирование MN и астроцитов спинного мозга в многоэлектродных пластинах

1. Дифференцировать и пластинировать моторные нейроны и астроциты, когда они готовы к использованию в тот же день и состарены in day in vitro (DIV) 60 для моторных нейронов и DIV 90 для астроцитов.
2. Покрытие пластин MEA за день до или в день нанесения покрытия выполняется следующим образом, если вы работаете с 24-луночными пластиковыми пластинами (Таблица материалов).
3. Разбавьте полиорнитин (PLO) в воде или фосфатно-солевом буфере (PBS) до 100 мкг/мл.
   1. Добавьте 15-20 мкл в каждую лунку (в зависимости от уровня комфорта пипетки), образуя каплю в центре лунки, охватывающую область электродов и окружающую область, но не всю лунку.
   2. Будьте осторожны, чтобы не повредить электроды наконечником пипетки. Соблюдайте объем от скважины к скважине, чтобы обеспечить охват одной и той же площади поверхности в каждой скважине.
   3. Инкубировать PLO при 37 °C в течение минимум 1 ч (предпочтительно 2 ч).
      заметка: Небольшие объемы высохнут, если в пластинах не будет достаточной влажности. Добавьте воду в отсеки, окружающие колодцы, чтобы обеспечить достаточную влажность на протяжении всего процесса нанесения покрытия и записи.
4. Отбирайте как можно больше PLO с помощью пластикового наконечника для микропипетки. Будьте осторожны, не прикасайтесь к электродам. Умыться 250 μЛ воды три раза. Если для промываний используется вакуумный аспиратор, не допускайте его приближения к электродной решетке. После третьего промывки удалите как можно больше воды, при необходимости используя наконечник для пипетки. Дайте поверхности высохнуть под колпаком для клеточных культур со снятой крышкой.
5. Как только поверхности пластин высохнут, добавьте ламинин, разведенный до 10 мкг/мл, в PBS. Используйте 15-20 мкл для покрытия каждой электродной решетки. Добавьте воду в отсеки для влажности, установите крышку на место и верните планшет для инкубации при температуре 37 °C в течение минимум 2 часов до ночи.
6. В день осаждения однократно промойте культуры моторных нейронов (МН) и астроцитов PBS и добавьте трипсин 0,05% при 37 °C для лифтинга клеток (5 мин). Соберите в коническую пробирку объемом 15 мл с ингибитором трипсина и промойте планшеты со средой или основанием, чтобы убедиться, что все клетки собраны. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут и повторно суспендируйте с помощью пипетки объемом 1000 мкл для получения 1 мл суспензии для одной клетки. При повторной суспендии MN и астроцитов следует перейти на среду для совместного культивирования (табл. 1) с добавлением 20 мкМ Rho-ассоциированного ингибитора серин-треонинкиназы (ROCK-I).
7. Подсчитайте МН и астроциты параллельно с помощью гемоцитометра. Во время подсчета и расчетов укупорьте суспензии элементов и поместите их в штатив из пенополистирола при температуре 4 °C.
8. Рассчитайте объем, необходимый для ресуспендирования культур до концентрации 5 x 10⁴ клеток на 5 мкл для моторных нейронов и 2,5 x 10⁴ клеток на 5 мкл для астроцитов. Центрифугируйте суспензию клеток объемом 1 мл при давлении 300 х г в течение 5 мин и повторно суспендируйте в рассчитанном объеме.
9. Рассчитайте желаемое количество лунок, которые необходимо засеять, и умножьте его на 5 мкл каждой клеточной суспензии. Смешайте необходимый объем суспензий нейронов и астроцитов в соотношении 1:1 и перемешайте пипетированием до полного смешивания (обычно дважды), но избегайте слишком агрессивных действий.
10. Удалите ламинин из каждой лунки планшета MEA с помощью наконечника для дозатора. Перенесите 10 мкл готовой комбинированной клеточной суспензии в каждую лунку, образуя небольшую каплю, покрывающую электродную решетку, чтобы обеспечить плотность клеток 5 x 10⁴ MN и 2,5 x 10⁴ астроцитов на лунку.
    заметка: Высокая плотность клеток в комбинированной суспензии требует частой повторной суспензии в промежутках между лунками на этапе посева для обеспечения точного и стабильного подсчета клеток.
11. Верните тарелки в инкубатор на 20-30 мин. Следите за тем, чтобы не потревожить каплю клеток и позволить клеткам сформировать первоначальные прикрепления на пластинах.
12. Через 20-30 минут добавьте теплую среду для совместной культуры + ROCK-I в каждую лунку, пипетируя 250 мкл вниз по стенке каждой лунки, а затем еще 250 мкл вниз по стенке той же лунки на противоположной стороне. Верните тарелку в инкубатор.
13. Осмотрите пластины на следующий день после посева (День 1 совместной культуры). Если имеется значительное количество клеточного мусора или мертвых клеток, замените среду на свежую среду для совместного культивирования, содержащую ROCK-I. В противном случае смените среду на второй день после посева (Co-Culture Day 2) на среду для совместной культуры без ROCK-I. Выполняйте полусредние замены (аспирируйте 50% и добавляйте 60% от конечного объема с учетом испарения) два раза в неделю.
14. При использовании систем MEA с однолуночными стеклянными пластинами диаметром 30 мм (Таблица материалов) подготовка пластины может занять 2 и более дней. Для этого выполните следующие действия.
15. Поднимите клетки и клеточный мусор из предыдущих культур МЭА с 0,05% трипсином в течение 5-15 минут.
16. Отсадите трипсин и трижды смойте водой.
17. Простерилизовать, добавив 70% этанола, и выдерживать в вытяжке в течение 10 мин. Отсадить этанол, а затем трижды промыть водой.
18. Нанесите 1% анионное моющее средство с ферментом протеазой в воду. Накройте пластины крышкой и оберните термопластичной пленкой и алюминиевой фольгой, а затем оставьте их на коромысле при комнатной температуре на ночь.
19. Отсадите моющее средство, а затем трижды смойте водой.
20. Если планируете хранить тарелки, добавьте достаточный объем воды. Накройте тарелки крышкой и оберните их термопластичной пленкой и алюминиевой фольгой и оставьте в холодильнике до следующего использования.
21. Если вы планируете наносить покрытие, дайте поверхности высохнуть под колпаком для клеточных культур.
22. Если требуется дополнительная стерилизация (например, предыдущая инфекция или недавнее использование), только на этом этапе подвергайте пластины MEA воздействию ультрафиолетового (УФ) света под капотом в течение 30-60 мин.<бр/> заметка: Избегание частого воздействия ультрафиолетового излучения предотвратит повреждение электродов. Использование ультрафиолетового излучения, когда на пластинах есть сыворотка, приведет к неработоспособности электродов, поэтому его следует использовать только на очищенных пластинах.
23. Когда пластины полностью высохнут, продолжайте плазменную очистку в течение 1 минуты, чтобы зарядить стеклянную поверхность пластин MEA и повысить эффективность покрытия. Плазменная очистка проводится не реже одного раза в 4-5 циклов очистки пластин MEA.
    1. В качестве альтернативы, когда очистка плазмы невозможна или не оправдана, добавьте достаточное количество среды, содержащей бычью сыворотку плода (FBS), чтобы покрыть поверхность планшетов MEA, и верните их в инкубатор на ночь.
24. Используйте покрытие PLO (полиорнитин)/ламинин. Добавьте раствор PLO (100 мкг в PBS) сразу после очистки или аспирации плазмы и промывки FBS-содержащей среды.
25. Наложите клетки, как указано выше, со следующей плотностью: 1 x 10⁵ человеческих плюрипотентных стволовых клеток, полученных из астроцитов (hiPSC-A) / планшет и 5^x 10 5 человеческих плюрипотентных моторных нейронов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC-MN) / планшет.

2. Запись с помощью многоэлектродной матрицы

1. Извлекайте исходные данные о напряжении с частотой дискретизации 12,5 кГц с помощью фильтра Баттерворта с фильтром высоких частот 200 Гц и фильтром низких частот 3 кГц. Задайте распознавание пиков в виде мгновенных временных точек напряжений ≥6 стандартных отклонений от базового уровня. Определите всплески как активность с >5 пиками за 100 мс. Определите сетевую активность, когда более 35% от общего числа активных электродов срабатывают в течение 100 мс с минимум 50 пиками за один сетевой всплеск.
2. Начните запись как можно скорее после Дня совместной культуры (CC) 1.
   заметка: Электрическая активность будет редко отмечаться до 3-го дня КК.
3. Планшеты параллельны культурам с одинаковой плотностью и реплицируются в соответствующих культуральных планшетах или покровных стеклах для биохимических анализов, иммуноцитохимии (ИКХ) или количественной ПЦР (кПЦР).
4. Выполняйте запись при температуре 37 °C и_CO2 на уровне 5%. Перенесите пластины в аппарат и дайте им сбалансироваться в течение как минимум 5 минут перед записью.
5. Записывайте исходную активность через день или еженедельно, в течение 1-15 минут в зависимости от плана эксперимента. Не записывайте в течение как минимум 1 часа после обмена носителями, а в идеале ждите 24 часа после каждого обмена медиа.
6. Для предотвращения контаминации смените среду (т.е. замените полусреду, как в шаге 1.14) после любой записи, при которой крышка стерильного планшета должна быть открыта за пределами стерильного колпака (т.е. применения лекарственных соединений). Выполняйте полную замену среды и промывание для вымывания лекарств, если пластины будут продолжать использоваться после медикаментозного лечения.
7. Для целей анализа используйте не менее трех технических и биологических репликатов для каждого состояния. Экспрессируйте электрофизиологические данные с помощью n ≥ 3 репликации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 см стерильные тарелки для культивирования	сокол	353003
25 см2 стерильных колбы для культуры	сокол	353136
500 мл 0,2 μм Система фильтрации CA	Корнинг	430769
Пипетка объемом 5 мл	сокол	357543
6 хорошо стерильных культуральных планшетов	сокол	No 3046
Планшеты Axion CytoView MEA 24 (M384-tMEA-24W)	Аксионного	ОПТ-24
Платформа Axion Edge MEA	Аксионного	Маэстро Эдж
Матрица базальной мембраны - Matrigel	Корнинг	354277	Подробности в протоколе
Настольный микроскоп (стерильный под колпаком для клеточных культур)	Цейсс	415510-1100-000	Примо Верт
Цилиарный нейротрофический фактор (CNTF)	Пепротех	450-13	Растворите 100 μг в 1 мл стерильного PBS, а затем добавьте 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS до 10 μг/мл. Аликвот и заморозьте при -80 ºC. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Баки CO2 и регулятор для Axion Edge	AirGas/Harris	9296НЗ
DMEM/F12	Термофишер	113300	Рабочая концентрация 1x
Добавка Essential 8 Medium + Essential 8	Термофишер	A1517001	Смешайте 10 мл добавки Essential 8 (10x) с 500 мл Essential 8 Growth Medium (1x)
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Термофишер	16140071	Рабочая концентрация 1x
Гемоцитометр	Выборы Науки о микроскопии	63510-20
Инкубатор для клеточных культур с контролируемой влажностью	ТермоФишер	370	установка на 37 ºC, 5 % CO2
Ламинин	Термофишер	No 23017-015	Исходный раствор 1 мг/мл, рабочая концентрация 10 мкг/мл (покрытие), 1 мкг/мл (клеточные среды)
L-глютамин	Термофишер	No 25030	Растворите 2 мг LDN в 500 мкл хлороформа, чтобы получить 10 мМ запаса. Закрепите это и заморозьте при -80 ºC. Для использования сначала разведите бульон от 1 до 10 в ДМСО [до 1 мМ], затем разбавьте 1:5000 1 мМ в желаемой среде, чтобы получить рабочий раствор 0,2 мкМ
Стеклянные пластины MEA	Многоканальные системы	60MEA200/30iR-Ti-gr	Рабочая концентрация 100x
Многоканальная пипетка P200	Гилсон	PJ22224
Нейробазальный	Термофишер	21103049
Заменимые аминокислоты (NEAA)	Термофишер	11140050	Рабочая концентрация 1x
Карандашлин/Стрептомицин	Термофишер	15140122	Рабочая концентрация 100x
Полиорнитин (PLO)	Сигма-Олдрич	П3655	Рабочая концентрация 100x
Хлорид калия (KCl)	NA	NA	Растворите 100 мг в 1 мл ddW, чтобы получить 100 мг/мл исходного раствора. Разложите поголовье по 100 мкл пробирок. (рабочая концентрация 100 мкг/мл)
Пурморфамин (ПМН)	Миллипор-Сигма	540223	Рабочая концентрация100 мМ
ROCK-ингибитор	Пепротех	1293823	Ненадолго центрифугируйте перед восстановлением. Растворите 100 мкг в 1 мл PBS до 100 мкг/мл, а затем добавьте 9 мл стерильного 0,1% BSA-PBS до 10 мкг/мл. Аликвот и заморозьте при -80 ºC. Разведите при 1:1000 для использования. (рабочая концентрация 10 нг/мл).
Стерильные колпаки для клеточных культур	Компания «Бейкер	СГ-600	Растворите 5 мг в 1480 мкл dH2O, чтобы получить 10 мМ запаса, аликвоту и заморозьте при -80 ºC. Разбавьте при 1:500 для использования. (рабочая концентрация 20 мкМ).
Дополнение B - B27 Дополнение	Термофишер	21985023
Настольная центрифуга для клеточных культур	ТермоФишер	75004261	Рабочая концентрация 50x
Термопластичная пленка - Parafilm	ПАРАФИЛЬМ	П7793	Sorvall Legend X1R
Трипсин-ЭДТА (0,05%)	Термофишер	2530054	Рабочая концентрация 1x
Водяная баня	ТермоФишер	No 2332	Изотемп