Одновременное измерение внутриклеточного кальция и мембранного потенциала в эндотелии головного мозга мыши

Аннотация

Источник: Хаким, М. А. и др. Одновременное измерение внутриклеточного кальция и мембранного потенциала в недавно изолированном и интактном эндотелии головного мозга мыши. J. Vis. Exp. (2019)

Видео демонстрирует одновременное измерение внутриклеточного уровня кальция и изменения мембранного потенциала в эндотелиальных клетках сегментов мозговой артерии мыши. Изолированная эндотелиальная трубка загружается флуоресцентным индикатором кальция и обрабатывается препаратом, который индуцирует внутриклеточное высвобождение кальция, что приводит к изменению мембранного потенциала. Флуоресценция индикатора позволяет измерять уровень кальция, а записывающий электрод вставляется в ячейку для измерения изменений мембранного потенциала.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Рассечение и изоляция мозговой артерии

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры вскрытия требуют увеличения образца (до 50x) с помощью стереомикроскопов и освещения, обеспечиваемого оптоволоконными источниками света. Для выполнения диссекционных процедур по выделению головного мозга и артерий используют заточенные диссекционные инструменты. Инструменты для микродиссекции для изоляции и очистки артерий включают заостренные щипцы с тонким наконечником и ножницы для рассечения в стиле Ваннаса (лезвия от 3 до 9,5 мм).

1. Изоляция мозга мыши
   1. Обезболите мышь C57BL/6 (в возрасте 3-30 месяцев; самец или самка) с помощью ингаляции изофлурана (3% в течение 2-3 минут), а затем обезглавьте животное сразу после полной индукции анестезии. Поместите голову в чашку Петри (диаметр 10 см, глубина 1,5 см), содержащую под стереомикроскопом холодный (4 °C) нулевой Ca²⁺ физиологический раствор соли (PSS).
   2. Рассматривая в микроскоп, удалите кожу и волосы над черепом и удалите излишки крови с холодным нулем Ca²⁺ PSS. Сделайте разрез, используя только кончики стандартных ножниц для препарирования (например, лезвия 24 мм), начиная с затылочной кости и продолжая вверх по носовой кости черепа.
   3. Осторожно вскрывайте череп вдоль разреза с помощью щипцов с крупными наконечниками и отделите соединительную ткань, чтобы изолировать мозг с помощью неповрежденного Виллисового круга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать щипцы для резки костей Литтауэра, чтобы вскрыть череп и обнажить мозг.
   4. Аккуратно промойте изолированный мозг холодным нулем Ca²⁺ PSS в стакане, чтобы удалить кровь. Поместите вентральную сторону мозга вверх в камеру с раствором для холодной диссекции для изоляции мозговых артерий (рисунок 1A).
2. Изоляция артерий головного мозга
   ПРИМЕЧАНИЕ: Задняя мозговая артерия была выбрана в качестве репрезентативной модели исследования эндотелия сосудов головного мозга для данного протокола.
   1. Закрепите изолированный мозг в холодном растворе для препарирования с помощью штифтов из нержавеющей стали (диаметр 0,2 мм, длина ~11–12 мм), которые должны быть вставлены в кремниевый полимер, наполненный древесным углем, дно (глубина ≥50 см) стеклянной чашки Петри.
   2. Для поддержания охлажденной температуры PSS во время вскрытия используйте камеру препарирования, охлаждаемую системой хладагента, непрерывно циркулирующей смесь воды и этиленгликоля в соотношении 1:1. В качестве альтернативы рассечение может быть выполнено на свежем льду.
   3. Хирургическим путем изолируйте задние мозговые артерии (сегменты от ~0,3 до 0,5 см, без осевого напряжения) от задних сообщающихся и базилярных артерий с помощью микродиссекционных инструментов ножниц типа Ваннас и заостренных щипцов с тонкими наконечниками (рис. 1B). С помощью штифтов из нержавеющей стали (диаметр 0,1 мм, длина ~13–14 мм) закрепите обе изолированные задние мозговые артерии в диссекционном растворе в чашке Петри (рис. 1C).
   4. Тщательно очистите изолированные задние мозговые артерии, удалив соединительную ткань с помощью заостренных щипцов с тонким наконечником (рисунок 1D). Разрежьте интактные артерии на сегменты (длиной 1–2 мм) для ферментативного расщепления (рисунок 1D; врезка).

2. Подготовка эндотелиальной трубки и суперфузион

1. Подготовьте аппарат для растирания с помощью микроскопа, оснащенного объективами (10x, 20x и 40x), камерой и алюминиевым столиком с камерой и микроманипуляторами. Закрепите микрошприц с помощью контроллера насоса рядом со столиком и образцом (рис. 2A).
2. Полностью заполните пипетку для растирания минеральным маслом и закрепите ее над поршнем микрошприца. Затем с помощью микрошприца с контроллером насоса вывести диссоциативный раствор в пипетку (~130 нл) поверх минерального масла, обеспечивая при этом отсутствие пузырьков воздуха в пипетке.
3. Поместите интактные артериальные сегменты в 1 мл диссоциационного раствора в стеклянную пробирку объемом 10 мл (рис. 2B), содержащую 0,31 мг/мл папаина, 0,5 мг/мл дитиоэритритола, 0,75 мг/мл коллагеназы и 0,13 мг/мл эластазы. Инкубировать при температуре 34 °C в течение 10–12 минут для частичного переваривания.
4. После разложения замените ферментный раствор ~5 мл свежего раствора диссоциации. С помощью пипетки объемом 1 мл перенесите один сегмент в камеру, содержащую диссоциативный раствор при комнатной температуре (RT).
5. Поместите пипетку в диссоциативный раствор в камере и расположите ее близко к одному из концов расщепленного сосуда. Установите скорость в диапазоне от 2 до 5 нл/с на контроллере насоса для мягкого растирания (рис. 2C; врезка).
6. При просмотре с увеличением от 100 до 200 раз извлекайте и выбрасывайте артериальный сегмент для диссоциации гладкомышечных клеток при образовании эндотелиальной трубки. При необходимости осторожно с помощью щипцов с тонким наконечником отделяют диссоциированную адвентицию и внутреннюю эластическую пластинку от эндотелиальной трубки. Подтвердите, что все гладкомышечные клетки диссоциированы и что только эндотелиальные клетки остаются в виде неповрежденной «трубки» (рисунок 2C).
7. С помощью микроманипуляторов закрепите каждый конец эндотелиальной трубки на стеклянном покровном стеколе камеры суперфузии с помощью пипеток с боросиликатным стеклом (рис. 2D).
8. Вымывают диссоциированные адвентиции и гладкомышечные клетки из камеры и заменяют раствор диссоциации 2 мМ CaCl₂ PSS. Перенесите мобильную платформу с защищенной эндотелиальной трубкой на микроскоп суперфузии и экспериментальную установку.
9. Используйте 6 чистых резервуаров объемом 50 мл (рис. 3A) для непрерывной подачи PSS и соответствующих лекарственных растворов во время эксперимента, в зависимости от ситуации. Используйте встроенный клапан регулирования расхода для ручной настройки расхода в соответствии с ламинарным потоком, при этом согласуя подачу потока с вакуумным всасыванием. Подайте PSS в камеру (рис. 3В) для суперфузии эндотелиальной трубки в течение ≥ 5 мин до записи фоновых данных и загрузки красителя.

3. Загрузка красителя, промывка и настройки температуры

1. Включите все компоненты фотометрической системы для измерения [Ca²⁺]_i. Используйте микроскоп на экспериментальном стенде (рис. 3C) для просмотра эндотелиальной трубки при 400-кратном увеличении и сфокусируйтесь на клетках в фотометрическом окне с помощью программного обеспечения фотометрической системы.
2. Измерьте диаметр эндотелиальной трубки и зарегистрируйте фоновые значения автофлуоресценции в соответствии с излучением 510 нм при попеременном возбуждении при 340 и 380 нм (≥10 Гц).
3. Чтобы измерить внутриклеточный ответ Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i), загрузите в эндотелиальную трубку краситель Fura-2 AM (Fura-2-ацетоксиметиловый эфир, конечная концентрация 10 мкМ) в режиме ОТ и дайте ~30–40 минут в отсутствие света.
4. Возобновите суперсфузию эндотелиальной трубки свежим PSS на ~30–40 минут, чтобы смыть избыток красителя и дать возможность внутриклеточному Fura-2 AM деэтерифицироваться. В течение периода вымывания постепенно повышайте температуру с RT до 37 °C с помощью регулятора температуры (рис. 3A) со встроенным нагревателем, затем поддерживайте температуру на уровне 37 °C на протяжении всего эксперимент><а. заметка: Рекомендуемый инкрементный переход от RT к 37 °C включает в себя три этапа (например, 5 °C) с временем уравновешивания ≥5 минут на каждом этапе.

4. Одновременное измерение [Ca²⁺]_i и V_m

1. Включите все остальное оборудование и программный комплекс электрометра для измерения мембранного потенциала (В_м, см. рис. 3, рис. 4). Отрегулируйте скорость сбора данных соответствующим образом (≥10 Гц).
2. Вытяните острый электрод и заполните 2 М KCl. Для изучения межклеточного взаимодействия через перенос красителя засыпают микроэлектроды 0,1% йодидом пропидия, растворенным в 2 М KCl.
3. Закрепите электрод на серебряной проволоке, покрытой хлоридом, в держателе пипетки, прикрепленном к столику головки электрометра, закрепленной микроманипулятором. С помощью микроманипулятора кратковременно поместите кончик электрода в проточный PSS в камере, одновременно наблюдая за происходящим через объектив с 4-кратным увеличением.
4. Установите значение V_m в состоянии покоя в 0 в соответствии с потенциалом заземленной ванны. Расположите кончик электрода непосредственно над ячейкой эндотелиальной трубки. При желании используйте звуковые базовые мониторы, подключенные к электрометрам, чтобы связать высоту звука с потенциальными записями.
5. Увеличьте увеличение до 400x с помощью 40-кратного объектива и при необходимости измените положение наконечника электрода. Отрегулируйте фотометрическое окно с помощью программного обеспечения для фотометрии, чтобы сфокусироваться на ~50–80 эндотелиальных клетках.
6. Аккуратно поместите электрод в одну из ячеек эндотелиальной трубки с помощью микроманипулятора и подождите ≥2 мин, пока состояние V_m в покое стабилизируется. Аналогичным образом вставьте второй электрод в другую ячейку (на расстоянии ≥100 мкм) от первой ячейки, проколотой первым электродом.
7. После того как Vm в состоянии покоя стабилизируется на ожидаемых значениях (от -30 до -40 мВ), включите ФЭУ на флуоресцентном интерфейсе в отсутствие света и начните регистрацию внутриклеточного [Ca²⁺]_i путем попеременного возбуждения Fura-2 (10 Гц) на длинах волн 340 и 380 нм при одновременном сборе флуоресцентного излучения на длине волны 510 нм.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки межклеточной электрической связи ток (± 0,5-3 нА, длительность импульса ~20 с) может быть подан через один электрометр как "Площадка 1", а изменения V_m могут быть зарегистрированы другим электрометром как "Площадка 2" (расстояние ≥100 мкм).
8. После того, как одновременные измерения Vm и [Ca²⁺]_i установлены, дайте ~5 мин для суперфузии эндотелиальной трубки с PSS при постоянной скорости ламинарного потока перед применением лекарственных препаратов.
9. Нанесите препарат (например, аденозинтрифосфат [АТФ]), приготовленный в ПСС, в камеру суперфузии с постоянной скоростью потока. Через ~3 минуты (или период времени, соответствующий кинетике препарата) смыть PSS до тех пор, пока V_m и соотношение F₃₄₀/F₃₈₀ не вернется к исходному состоянию. Помечайте соответствующие записи как синхронизированные по времени между программными пакетами фотометра и электрометра во время каждого перехода решений.
10. Как только эксперимент будет завершен, извлеките электрод из ячейки с помощью микроманипулятора и обратите внимание на V_m ~0 мВ, на которое указывает электрод ванны. Остановите соответствующие записи V_m и [Ca²⁺]_i и сохраните записи в файле для анализа данных.

Результаты

Рисунок 1: Изоляция мозговой артерии от мозга. (A) Изолированный мозг с интактными артериями (белая стрелка указывает на заднюю мозговую артерию) в растворе для рассечения. (B) Увеличенный вид задней мозговой артерии (белая стрелка; ~3x противПанель А). (C) Изолированные задние мозговые артерии, закрепленные штифтами из нержавеющей стали в ч...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
глюкоза	Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)	Г7021
NaCl	сигма	С7653
MgCl2	сигма	М2670
CaCl2	сигма	223506
ХЕПЕС	сигма	Н4034
KCl	сигма	П9541
НаОХ	сигма	С8045
СПС	сигма	А2383
список совместимого оборудования	ThermoFisher Scientific (Питтсбург, Пенсильвания, США)	A466250
Коллагеназа (смесь типа H)	сигма	С8051
Дитиоэритритол	сигма	Д8255
папаин	сигма	П4762
Эластаза	сигма	Е7885
БСА	сигма	А7906
Йодид пропидия	сигма	П4170
Дмсо	сигма	Д8418
Краситель Фура-2 АМ	Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США	Ф14185
Рециркуляционный охладитель (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Камера суперплавления из оргстекла	Warner Instruments, Камден, Коннектикут, США	РК-27
Стеклянное покровное дно (2,4 × 5,0 см)	ThermoFisher Scientific	12-548-5М
Платформа из анодированного алюминия (диаметр: 7,8 см)	Уорнер Инструментс	PM6 или PH6
Компактная алюминиевая сцена	Сискию, Грантс-Пасс, Орегон, США	8090П
микроманипулятор	Сискию	МХ10
Стереомикроскопы	Zeiss, штат Нью-Йорк, США	Stemi 2000 & 2000-C
Волоконно-оптические источники света	Schott, Майнц, Германия и KL200, Zeiss	Фостек 8375
Инвертированный микроскоп Nikon	Nikon Instruments Inc, Мелвилл, штат Нью-Йорк, США	Ц2
Объективы фазового контраста	Компания Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Флуоресцентные объективы	Компания Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) и 40X (Plan Fluor)
Инвертированный микроскоп Nikon	Компания Nikon Instruments Inc	Затмение TS100
Контроллер микрошприцевого насоса (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Сарасота, Флорида, США	SYS-MICRO4
Виброизоляционный стол	Техническое производство, Пибоди, штат Массачусетс, США	Микро-г
Усилители	Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США	Axoclamp 2B и Axoclamp 900A
Головные уборы	Молекулярные приборы	HS-2A и HS-9A
Генератор функций	EZ Digital, Сеул, Южная Корея	ФГ-8002
Система сбора данных	Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США	Digidata 1550А
Звуковые базовые мониторы	Ampol US LLC, Сарасота, Флорида, США	БМ-А-ТМ
Цифровой запоминающий осциллограф	Tektronix, Бивертон, Орегон, США	TDS 2024B
Интерфейс флуоресцентной системы, дуговая лампа + источник питания, гиперпереключатель, ФЭУ	Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США	Системы IonOptix
Регулятор температуры	Уорнер Инструментс	TC-344B или C
Встроенный нагреватель	Уорнер Инструментс	Ш-27Б
Контроллер клапана	Уорнер Инструментс	ВК-6
Встроенный клапан регулирования расхода	Уорнер Инструментс	ФР-50
Электронный съемник	Sutter Instruments, Новато, Калифорния, США	-97 или-1000
Микрокузница	Narishige, Ист-Мидоу, Нью-Йорк, США	МФ-900
Трубки из боросиликатного стекла (растирание)	World Precision Instruments (WPI), Сарасота, Флорида, США	1В100-4
Трубки из боросиликатного стекла (штифты)	Уорнер Инструментс	Г150Т-6
Трубки из боросиликатного стекла (острые электроды)	Уорнер Инструментс	ГК100Ф-10
Шприцевой фильтр (0,22 мкм)	ThermoFisher Scientific	722-2520 (Английский)
Стеклянная чашка Петри + уголь Сильгард	Контрольно-измерительные приборы для живых систем, Сент-Олбанс-Сити, Вермонт, США	ДД-90-С-БЛК
Ножницы в стиле Vannas (3 мм и 9,5 мм)	Мировые прецизионные приборы	555640С, 14364
Ножницы с лезвиями 3 и 7 мм	Fine Science Tools (или FST), Фостер-Сити, Калифорния, США	Moria MC52 и 15000-00
Заточенные щипцы с тонким наконечником	ФСТ	Дюмон #5 и Дюмон #55