Методическая статья

Оценка формирования нейронных связей в кокультуре с использованием электрофизиологических записей

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Su, C. T. E., et al. Оптогенетический подход для оценки формирования нейронных связей в системе совместной культуры. J. Vis. Exp. (2015)

Видео демонстрирует электрофизиологическую запись для оценки нейронных связей между нейронами, полученными из iPSC, и кортикальными нейронами крысы, подтверждая синаптические контакты в кокультуре путем активации светочувствительных ионных каналов и обнаружения постсинаптических токов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Электрофизиологические записи нейронов, полученных из iPSC

  1. Подтвердите, ведут ли себя человеческие ИПСК как зрелые нейроны.
    1. Найдите клетки, дифференцированные от человеческих iPSCs, путем визуализации tdTomato с помощью вертикального конфокального микроскопа, оснащенного линзой погружения в воду с углом 60X (0,9 NA).
    2. Натяните записывающую пипетку на сопротивление от 4 до 6 М. Перфузируйте ячейки при комнатной температуре во внешнем растворе, постоянно пузырчатом с 95% O, 2/ 5% CO2. Наполните записывающую микропипетку внутренним раствором.
    3. Заплатите за ячейку tdTomato+ в режиме всей ячейки и запишите возбуждение потенциала действия в ответ на текущую инжекцию (продолжительность 1 сек, шаг 10 пА) в текущем зажиме.
  2. Подтвердите, надежно ли световая стимуляция вызывает потенциал действия клеток коры головного мозга, экспрессирующих ChR2.
    1. Найти корковые клетки, экспрессирующие ChR2, путем визуализации GFP под конфокальным микроскопом. Выполните запись патч-клэмпа на корковых клетках, выполнив шаги с 1.1.2 по 1.1.3.
    2. Убедитесь, что потенциал действия надежно вызывается световым освещением ртутной дуговой лампой (100 Вт). Длина волны фильтра возбуждения составляет 480/40 нм.
  3. Проводят оптогенетическую стимуляцию.
    1. Пропатчируйте ячейку tdTomato+ в режиме всей ячейки и установите напряжение клещи на -70 мВ. Фильтруйте токовые сигналы на частоте 2 кГц и оцифровывайте на частоте 10 кГц. Контролируйте последовательное сопротивление в диапазоне от 10 до 20 М для обеспечения стабильности во время записи.
    2. Стимулируйте все поле ртутной лампой мощностью 100 Вт с фильтром возбуждения 480/40 нм в течение 30 сек.
    3. Записывайте постсинаптические токи (ПСК) пораженных клеток, индуцированные фотостимуляцией ChR2-экспрессирующих пресинаптических корковых нейронов. Обнаружение и измерение PSC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NaClсигмаС7653
KClсигмаП5405
НаОГС3сигмаС5761
2PO4Флюка71505
MgCl2сигмаМ8266
CaCl2сигмаС1016
D(+)-глюкозасигмаГ7520Для электрофизиологических исследований
К-глюконатсигмаС1847
КоКАНТО Кемикал3234400 (Английский
ХЕПЕСсигмаН3375Для электрофизиологических исследований
ЭГТАсигмаЕ3889
Na2АТФсигмаА7699
Д/о3ГТПсигмаГ8877
Капилляры из боросиликатного стеклаМировые прецизионные приборы, Inc1604323
Ртутная короткодуговая лампаКомпания OSRAMHBO 103 W/2
)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

whole cell patch clamp

Похожие статьи