Визуализация никотин-индуцированной передачи сигналов кальция вдоль вентральных аксонов гиппокампа в синаптических культурах

Аннотация

Источник: Zhong, C., et al., Живая визуализация никотиновой передачи сигналов кальция и высвобождения нейротрансмиттеров вдоль вентральных аксонов гиппокампа. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует, как никотин-опосредованная активация никотиновых ацетилхолиновых рецепторов в вентральном гиппокампе мыши приводит к устойчивой передаче кальциевых сигналов вдоль аксонов.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Визуализация кальция

1. Быстро промойте культуры (5 - 7 дней in vitro) нормальным HBS, затем загрузите культуры с показателем 5 μM Fluo-4 Ca⁺ (AM-эфир) и 0,02% Pluronic F-127 в HBS (2 мл) в течение 30 минут при 37 °C и 5%_CO2.
2. Смойте раствор Fluo-4 с помощью HBS (3 раза/5 мин). Верните культуры в инкубатор (37 °C / 5%_CO2) не менее чем на 30 минут.
3. Выдерживайте бактериологическое исследование (5 - 7 дней in vitro) в камере для визуализации и устанавливайте камеру на вращающийся дисковый конфокальный микроскоп. Непрерывно перфузируйте (1 мл/мин) коктейлем HBS при RT.
4. Соберите флуоресцентные изображения аксональных проекций Fluo-4 из микросрезов vHipp с помощью объектива Plan-Apochromat (60-кратная вода с 1,4 NA, возбуждение 488 нм, излучение 530 нм) и ПЗС-камеры.
5. Соберите исходные флуоресцентные изображения Fluo-4 (каждые 10 секунд в течение 2 минут) в качестве предникотинового контроля. Нанесите никотин (1 мкМ) методом быстрой перфузии (2 мл/мин) в течение 1 минуты, затем смойте никотин коктейлем HBS. Продолжайте делать цейтраферную съемку до, во время и после применения никотина каждые 10 секунд в течение 30 минут.
6. Сохраните все кадры необработанных флуоресцентных изображений fluo-4 и экспортируйте их в виде серии изображений в формате TIFF для дальнейшего анализа.
7. Соберите интегральную интенсивность флуоресценции флуоресценции fluo-4 вдоль аксонов vHipp до и после применения никотина.
8. Нормализуйте интегральную интенсивность флуоресценции с помощью следующего уравнения: ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀, где F₀ — скорректированная на фон интенсивность интегральной флуоресценции до никотина, а F — интегральная интенсивность флуоресценции вдоль аксонов vHipp в каждый момент времени после применения никотина. Анализ и построение графика нормализованной интенсивности интегральной флуоресценции.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коктейль HBS для визуализации в реальном времени pH=7,3
NaCl	сигма	С9888	135 мМ
KCl	сигма	П9333	5 мМ
Хлорид магния	сигма	М8266	1 мМ
Хлорид кальция	сигма	С1016	2 мМ
ХЕПЕС	сигма	Н3375	10 мМ
глюкоза	сигма	G0350500	10 мМ
Тетродотоксин	Токрис	1078	2 мкМ
Бикукуллин	Токрис	131	10 μМ
Д-АП-5	Токрис	105	50 мкМ
CNQX	Токрис	1045	20 μМ
LY341495	Токрис	1209	10 μМ

г. г. г.