Исследование удлиненного деполяризующего послепотенциала (ОАП) в фоторецепторах дрозофилы

Аннотация

Источник: Гуторов, Р., и др. Электрофизиологические методы измерения уровня фотопигмента в фоторецепторах дрозофилы. J. Vis. Exp. (2022).

Это видео демонстрирует экспериментальный протокол для исследования длительного деполяризующего послепотенциала (PDA) у белоглазой дрозофилы. Глаз мухи подвергается воздействию интенсивных импульсов синего света для преобразования фотопигмента родопсина в метародопсин, инициируя сигнальный каскад, который открывает каналы положительных ионов и вызывает деполяризацию мембраны. Поскольку синий свет препятствует реконверсии метародопсина в родопсин, непрерывный приток положительных ионов приводит к устойчивой деполяризации, известной как пролонгированный деполяризующий послепотенциал (PDA).

Протокол

1. Измерение длительного деполяризующего послепотенциала (PDA) с помощью электроретинограммы

1. Подходящие условия выращивания для препарата Drosophila melanogaster
   1. Мухи Raise D. melanogaster содержатся в бутылках, содержащих стандартную желтую кукурузу, содержащую пищу, в инкубаторе, поддерживаемом при температуре 24 °C и в 12-часовом цикле темный/светлый.
   2. Держите флаконы с мухами в темноте не менее 24 часов до начала эксперимента.
2. Общая настройка
   1. Подготовьте записывающие пипетки, вытягивая заполненные волокном капилляры боросиликатного стекла размером 1 мм x 0,58 мм (Наружный диаметр x внутренний диаметр) (рис. 1L, O). Сопротивление пипеток должно составлять 5-10 МОм; Можно использовать любой подходящий съемник.
   2. Покройте два серебряных провода AgCl₂, вставив серебряный провод 0,25 мм в раствор 3M KCl, подключенный к специально изготовленному источнику питания 5 В.
   3. Вставьте каждую серебряную проволоку с покрытием в держатели электродов (рис. 1N).
   4. Заполните стеклянный капилляр отфильтрованным раствором Рингера (см. Таблицу 1) с помощью шприца с удлиненным наконечником (Рисунок 1M).
   5. Вставьте проволочный электрод в стеклянный капилляр. Убедитесь, что раствор внутри капилляра соприкасается с серебряной проволокой.
   6. Вставьте держатели электродов (рис. 2P, N) в два электродных микроманипулятора (рис. 2G).
3. Порядок подготовки мухи к электрозаписи
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удержать муху в условиях, адаптированных к темноте, используйте только тусклое освещение красным светом во время следующих шагов.
   1. Обезболите мух в бутылке с газом CO₂ с помощью системы «Fly sleeper» (рис. 1A, B) и вылейте их в контейнер для сна.
   2. Выберите одну муху и аккуратно держите ее за крыло с помощью острого пинцета. Накройте остальных мух чашкой Петри.
   3. Поместите ширинку на держатель для мух в правильной ориентации - лежа на боку, спиной к руке (рисунок 1P).
   4. Включите питание паяльника. Установите ток на ~2,25 А. Этот ток должен нагревать платино-иридиевую нить диаметром 0,25 мм до ~55-56 °C.
   5. Нанесите на паяльник каплю воска с низкой температурой плавления (~55-56 °C) (рисунок 1F).
   6. С помощью пинцета поднимите муху с крыльев и зафиксируйте крылья к держателю мухи (рис. 1I) с помощью паяльника.
   7. С помощью паяльника соедините заднюю часть мухи с поверхностью подставки с помощью воска (рисунок 1P).
   8. Опустите наконечник паяльника на точку соединения ножек и расплавьте воск, чтобы покрыть все ножки вместе (Рисунок 1P).
   9. Поместите небольшую каплю воска между головой и спиной в области шеи (Рисунок 1P).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте особую осторожность, чтобы не допустить перегрева головки мухи. Убедитесь, что муха правильно закреплена и не может двигаться во время эксперимента; Незначительные движения могут создавать артефакты в записях. Следите за тем, чтобы отверстия трахеи (дыхательные входы) в грудной клетке и брюшной полости не были покрыты воском.
   10. Поместите держатель мухи (Рисунок 2Q) в темную клетку Фарадея на магнитный блок (Рисунок 2I) и убедитесь, что мушка находится на расстоянии ~5 мм от конца световода (Рисунок 2L).
   11. Поместите записывающий электрод (рисунок 2P) над глазом мухи, а заземляющий электрод (рисунок 2N) — над верхней частью спины мухи с помощью микроманипуляторов.
   12. Вставьте заземляющий электрод в заднюю часть мушки с помощью микроманипуляторов.
   13. Вводите записывающий электрод во внешнюю периферию глаза мухи, предпочтительно, с помощью микроманипуляторов.
       заметка: После введения электрода в глаз будет наблюдаться небольшая ямочка; Потяните электрод вверх, не извлекая его из глаза, пока ямочка не исчезнет. Электроды также могут быть погружены в мелкие капли электродного желе, нанесенного на туловище и глаз.
4. Протокол PDA (этот протокол может быть выполнен только на белоглазых мухах)
   1. Дайте световой импульс максимальной интенсивности в 5 секунд с помощью оранжевого фильтра (фильтр по краю 590, для преобразования максимального фотопигмента в R-состояние).
   2. Замените оранжевый фильтр на широкополосный синий (BP450/40 нм) фильтр и подайте три световых импульса по 5 с максимальной интенсивностью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно подавать длинный непрерывный импульс синего света максимальной интенсивности до тех пор, пока не будет достигнут устойчивый отклик напряжения.
   3. Подождите 60 с в темноте, замените синий фильтр на предыдущий оранжевый фильтр и дайте два световых импульса по 5 с интервалом 60 с.

Таблица 1: Состав раствора Рингера

Решение Рингера
реагент	Концентрация (мМ)
NaCl	130
KCl	2
MgCl2	5
CaCl2	2
ХЕПЕС	10
Титрование pH до 7,15 с использованием NaOH и HCl

Результаты

Рисунок 1: Инструменты и устройства, необходимые для фиксации мух и регистрации приготовления пипетки. (A) Система спального места на флайбридже; (B) Педаль системы спального места; (В) Источник холодного света; (D) Стереоскопический микроскоп; (E) Нагреватель восковой нити; (F) Паяльник; (G) Педаль нагревателя восковой нити; (H) Грубый пинцет; (I) Магнитная подставка для мух; (J) Воск с низкой темпе...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприц объемом 1 мл с удлиненным наконечником			Рисунок 1М
1 грубый пинцет		Дюмон #5, Стандарт	0,1 мм x 0,06 мм, длина 110 мм, нержавеющая сталь (Рисунок 1H)
2 линзы конденсора
Аналого-цифровой преобразователь	Молекулярное устройство	Диджидата 1200	Возможная замена: любые дигиданные от молекулярных устройств (например, 1440A) - Рисунок 2C
усилитель	Почти идеальная электроника		Возможная замена: инструменты Warner - IE251A или IE-210 (поставляется с напорным устройством) - Рисунок 2D
Антивибрационный стол	Ньюпорт	VW-3036-OPT-01	Рисунок 7H
Капилляров	Гарвардский аппарат	Капилляры из боросиликатного стекла	1 мм x 0,58 мм (Рисунок 1O)
Зажим	Молекулярное устройство		программное обеспечение
Баллон с CO2
Источник холодного света	Шотт	ЖК-дисплей KL1500	Рисунок 1С
Деликатные дворники	Кимтех		Кимвайпы (Рисунок 1K)
Держатель электродов			Подходит для капиллярного диаметра 1 мм (Рисунок 1N, Рисунок 2N и Рисунок 2P)
Клетка Фарадея	Домашнее изготовление		Электромагнитный шумозащитный экран и черная передняя шторка (Рисунок 2K)
Фильтр (Цвет)	Шотт	OG590, Краевой фильтр	Рисунок 2S
Фильтр (Цвет)	Шотт	BP450/40 нм	Рисунок 2S
Фильтр (Цвет)	Блейзеры	550 нм	Рисунок 2S
Фильтр (Цвет) для холодного источника света	Шотт	РГ630	Рисунок 1С
Фильтр (Тепло)	Шотт	КГ3	Рисунок 1S
Фильтры (фильтр нейтральной плотности)	Цветность	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Рисунок 2S
Система импульсных ламп	Ханивелл		Рисунок 2U
Система Fly sleeper с инжектором	Inject + matic		Рисунок 1A-B
Блок питания от лампы	ПТИ	ЛПС-220	Рисунок 2W
Детектор света	Домашнее изготовление		Фототранзистор (Рисунок 2O)
Световод			Диаметр 3 мм, длина 1,3 м (Рис. 2L,M)
источник света			Безозоновая ксеноновая лампа высокого давления мощностью 75 Вт (работает от 50 Вт), возможная замена: Cairn research - OptoLED (Рисунок 7R)
Низкотемпературный плавильный воск	Домашнее изготовление		Состоит из смеси пчелиного воска (Tm≈62 °C) и парафина в соотношении ~3:1 для достижения температуры плавления ~55–56 °C (Рисунок 6J)
Магнитная подставка для мух	Домашнее изготовление		Рисунок 1I и Рисунок 2Q
Микроэлектродная система предусилителей с напорным столиком	Почти идеальная электроника		Тестер импеданса (Рисунок 2G)
Микроманипулятор (механический грубый)	Tritech Research, Нарисигэ	М-2
Микроманипулятор (механический тонкий)	Лейтц Микросистемы	Механический микроманипулятор Leitz	Рисунок 2F
pCLAMP	Молекулярное устройство		программное обеспечение
чашка Петри			60 мм
Генератор импульсов	АМПИ	Мастер 8	Рисунок 2А
Крем Redux для электрокардиографии	Лаборатории Паркера	Redux Electrolyte Crème
Отвертка затвора	Uniblitz, Винсент Ассошиэйтс	VCM-D1 Одноканальный одностабильный	Рисунок 2V
Система жалюзи	Uniblitz, Винсент Ассошиэйтс	LS2 2 мм Одностабильные ставни	Рисунок 2V
Серебряная проволока	Уорнер Инструментс		0,25–1 мм в диаметре, нуждается в хлорировании
Паяльник, состоящий из платино-иридиевой нити накаливания			Диаметр 0,25 мм (Рисунок 2F)
Стереоскопический зум-микроскоп	Компания Nikon	СМЗ-2Б	Рисунок 1D
Стереоскопический зум-микроскоп	дикий	Вайлд М5	С настройками увеличения 6, 12, 25 и 50 (Рисунок 2E)
Шприцевые фильтры	Миллэкс		Фильтр из ПВДФ 22 μм
Вертикальный съемник пипеток	Саттер/ Нарисигэ	Модель-97/ПП-830	Используйте вертикальный или горизонтальный съемник, по желанию (Рисунок 1L)
Нагреватель восковых нитей	Домашнее изготовление		Рисунок 1E-G
Ксеноновая система вспышек	Доктор Рапп ОптоЭлектроника	ЯМЛ-С2	Рисунок 2X