Визуализация и картирование нейронных путей в срезе миндалевидного тела

Abstract

Источник: Bosch, D., et al. Ex vivo Оптогенетическое препарирование цепей страха в срезах мозга. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует процедуру анализа синаптической связи между медиальной префронтальной корой (mPFC) и нейронами миндалевидного тела с использованием острых срезов мозга миндалевидного тела у мышей. Нейроны mPFC у этих мышей экспрессируют каналродопсин, слитый с флуоресцентным белком. Каналродопсины способствуют притоку ионов и генерации потенциала действия в нейронах mPFC при активации света. Следовательно, нейроны mPFC высвобождают нейротрансмиттеры, которые связываются с постсинаптическими нейронами миндалевидного тела, запуская постсинаптические токи, которые записываются для визуализации связи mPFC-миндалевидного тела.

Protocol

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Визуализация и стимуляция пресинаптических волокон

1. Подготовьте патч-микроскоп для оптогенетической активации волокон и клеток:
   1. Расположите установленный светодиод (LED) по центру пути подачи света.
   2. Измерьте интенсивность светодиодного света в задней фокальной плоскости и на выходе каждого объектива с помощью измерителя мощности, выбрав подходящую длину волны 470 нм.
   3. Рассчитайте интенсивность света в мВт/^мм2 и создайте калибровочную кривую (зависимость интенсивности светодиода (%) от светоотдачи (мВт/^мм2)) для каждого объектива для значений, измеренных для длины волны 470 нм.
2. Извлеките острый срез миндалевидного тела из интерфейсной камеры и поместите его в камеру для среза, установленную на вертикальном микроскопе, оснащенном люминесцентной лампой. Позаботьтесь о том, чтобы срез располагался таким образом, чтобы поверхность среза, обращенная вверх в камере интерфейса, также была направлена вверх в камере записи. Перфузионный срез свежей, насыщенной кислородом искусственной спинномозговой жидкостью (АКСФ) со скоростью 1 - 2 мл/мин при температуре ~31 °С.
3. Наблюдайте за пресинаптическими волокнами в срезе с помощью люминесцентной лампы в сочетании с соответствующими наборами фильтров для экспрессируемого специфического флуоресцентного белка. Используйте объектив 5x для получения обзора (рис. 1E) и объектив 60x для оценки плотности волокна в целевой области.
   Примечание: Для GFP и YFP используйте набор фильтров "зеленый" (Возбуждение 472/20, Светоделитель 495, Излучение 490 LP), для mCherry используйте набор фильтров "красный" (Возбуждение 560/40, Светоделитель 585, Излучение 630/70), как указано в таблице материалов/оборудования.
4. Откройте или ограничьте апертуру в световом тракте микроскопа по желанию эксперимента (рис. 2D).
5. Для получения патч-записи необходимо заполнить патч-пипетку внутренним раствором и установить ее в держатель электродов. Надавите на пластырь-пипетку и медленно опустите ее сначала в раствор для ванны, а затем под визуальным контролем в срез с помощью микроманипулятора.
   1. Подойдите к интересующему нейрону с помощью патч-пипетки сбоку и сверху. Сбросьте положительное давление, когда пипетка находится на поверхности ячейки (ямочка видна на поверхности ячейки) и получите «гигауплотнение», применяя отрицательное давление.
   2. Примените дополнительную аспирацию, чтобы разорвать мембранный пластырь и получить запись всей клетки. Затем стимулируйте меченые волокна с помощью подключенного светодиода, используя соответствующую длину волны для активации каналродопсина (ChR) (470 нм) при одновременной регистрации электрических откликов от клетки.
   3. Для синаптической стимуляции начинайте с низкой интенсивности светодиода и увеличивайте до тех пор, пока не будет достигнута желаемая амплитуда синаптического тока. Активируйте светодиод, настроив цифровые выходы в программном обеспечении для сбора данных для управления временем и длиной импульса (примеры на рисунке 3).
      Примечание: для запуска светодиодов можно использовать другое программное обеспечение и/или устройства, генерирующие TTL.
6. Повторите стимуляцию с открытой или ограниченной апертурой (шаг 1.4) в световом тракте микроскопа по желанию для следующей зарегистрированной клетки и/или в присутствии определенных лекарственных препаратов.

Results

Рисунок 1. Стереотаксические инъекции, подготовка острых срезов мозга и визуализация пресинаптических волокон. (А, Б) Стереотаксическая инъекция вируса. А) Изображение мыши, находящейся под наркозом, помещенной в стереотаксическую рамку с обнаженным черепом и пипеткой для инъекций. Вставка: Увеличьте изображение инъекционной пипетки, наполненной вирусным раствором, смешанным с быстры...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Искусственная спинномозговая жидкость (АКШФ)	Композицию см. в ссылках #16 и #23
Решения для внутренних патчей	Композицию см. в ссылках #16 и #23
Сульфат магнияГептагидрат	Рот, Германия	Р027.1	приготовить исходный раствор 2М в очищенной воде
Стереоскоп, SZX2-RFA16	Олимп, Япония
Люминесцентная лампа Xcite (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Канада	2012-12699
Патч-микроскоп, BX51WI	Олимп, Япония
Патч-усилитель Multiclamp 700B	Молекулярные приборы, США
Цифровые данные 1440А	Молекулярные приборы, США
Программное обеспечение PClamp, версия 10	Молекулярные приборы, США		используется для управления сбором данных и стимуляцией
Регулятор температуры ванны, TC05	Luigs & Neumann, Германия	200-100 500 0145
Трехосевой микроманипулятор Mini 25	Luigs & Neumann, Германия	210-100 000 0010
Контроллер микроманипулятора SM7	Luigs & Neumann, Германия	200-100 900 7311
Стеклянные капилляры для патч-пипеток	World Precision Instruments, Германия	ГБ150Ф-8П
Фильтровальная бумага из нитрата целлюлозы для интерфейсной камеры	Satorius Stedim Biotech, Германия	13006--50----ACN
Светодиодный блок, CoolLED pE	CoolLED, Великобритания	244-1400	CoolLED или USL 70/470 и соответствующие адаптеры являются двумя альтернативными вариантами для светодиодной стимуляции
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, Великобритания	pE-АДАПТЕР-50E
Светодиодный блок, USL 70/470	Рапп Оптоэлектроника	Л70-000
Адаптер с двумя портами	Рапп Оптоэлектроника	Обратиться в компанию
Фильтр установлен красным (возбуждение)	AHF, Германия	Ф49-560	Фильтры можно купить в комплекте F46-008
(светоделитель)	AHF, Германия	Ф48-585
(излучение)	AHF, Германия	Ф47-630
Фильтр установлен зеленым цветом (возбуждение)	AHF, Германия	Ф39-472	Альтернативы: набор фильтров F36-149 или F46-002 (с полосовым излучением)
(светоделитель)	AHF, Германия	Ф43-495В
(излучение)	AHF, Германия	Ф76-490
LaserCheck, портативный измеритель мощности	Coherent, США	1098293
Программное обеспечение IgorPro, версия 6	Wavemetrics, США		Для анализа данных электрофизиологии могут быть использованы и другие альтернативные программные пакеты
Нейроматический набор макросов для IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com