Регистрация электроретинограммы и визуального вызванного потенциала у крысы

Аннотация

Источник: Charng, J. et al. Имплантация и запись беспроводной электроретинограммы и визуального вызванного потенциала у сознательных крыс. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует, как записать электроретинограмму (ЭРГ) и визуальный вызванный потенциал (ВЭП) у сознательной крысы. Крыса с хирургически имплантированными электродами сначала адаптируется к темноте. После нанесения расширяющих капель животное помещают в удерживающее устройство и помещают в чашу Ганцфельда. Затем регистрируются сигналы ERG и VEP.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка электродов

Примечание: Для хирургической имплантации используется трехканальный передатчик, который позволяет одновременно проводить 2 электроретинограммы (ЭРГ) и 1 запись визуального вызванного потенциала (VEP). Перед имплантацией три активных и три неактивных электрода должны быть предварительно приданы форме кольца, чтобы прикрепить их к глазу. В целях идентификации производитель заключил активные электроды в полубелые, наполовину окрашенные пластиковые оболочки, в то время как неактивные электроды покрыты полноцветными оболочками. Заземляющий электрод (прозрачная пластиковая оболочка) остается неизменным для всех активных и неактивных электродов для выполнения шагов 1.1, 1.2, 1.3 и 1.7.

1. Раскрутите двухцепочечный электрод из нержавеющей стали двумя плоскогубцами с тонким наконечником.
2. Обрежьте одну из нитей из нержавеющей стали (примерно в 1 см от кончика), оставив одну более длинную прямую прядь для придания формы кольцевому электроду.
3. Сложите одинарную нить из нержавеющей стали обратно на себя и скрутите, образуя гладкое кольцо на кончике электрода.
4. Для активных электродов ERG сформируйте эту петлю диаметром ~ 0,2 - 0,5 мм, скрутив основание петли (для описанной здесь цели сформируйте таким образом два активных электрода, чтобы регистрировать ERG от обоих глаз), а для неактивных электродов ERG и электродов VEP сделайте диаметр петли ~ 0,8 мм диаметром (в этом примере сделайте это для одного активного электрода VEP и всех трех неактивных электродов).
5. Зацепите круглый активный электрод VEP вокруг винта из нержавеющей стали (диаметр 0,7 мм, длина 3 мм) так, чтобы электрод упирался в головку винта.
6. Зацепите 3 неактивных электрода (2 ERG, 1 VEP) вокруг второго винта из нержавеющей стали (диаметр 0,7 мм, длина 3 мм).
7. Потяните пластиковую втулку вперед за острые концы двух нитей из нержавеющей стали, чтобы уменьшить раздражение.
8. Простерилизуйте передатчики телеметрии, замочив их в 2% глутаральдегиде более чем на 10 часов при температуре около 25 °C. Затем трижды промойте трансмиттер стерильным физиологическим раствором.

2. Имплантация передатчика

1. Подготовка животных
   1. Перед экспериментом продезинфицируйте операционную область, очистив ее 70% этанолом. Автоклавируйте все хирургическое оборудование перед использованием и поддерживайте оборудование в хлоргексидине, когда оно не используется во время операции. Накрывайте животное хирургической простыней во время операции для поддержания стерильной среды. Убедитесь, что все экспериментаторы носят хирургические маски, стерильные перчатки и халаты.
   2. Индуцировать анестезию 1,5 - 2% изофлураном со скоростью потока 3 л/мин и поддерживать ее на уровне 1,5 - 2% при 2 л/мин на протяжении всей операции. Подтверждают достаточную глубину анестезии отсутствием педального рефлекса при защемлении мышцы между пальцами ног.
   3. Выбрейте область размером 40 мм х 30 мм над животом от паха до грудины.
   4. Выбрейте участок размером 30 мм x 20 мм над лбом, сзади от глаз и спереди от ушей.
   5. Продезинфицируйте два выбритых участка. Область лба продезинфицировать 10% повидон-йодом три раза (избегайте использования антисептиков на спиртовой основе для области вокруг глаза, что соответствует Стандарту практики, установленному Ассоциацией хирургических технологов). Над животом продезинфицируйте 10% повидон-йодом и 70% этанолом.
   6. Нанесите 1 каплю проксиметакаина на роговицу для дополнительной местной анестезии.
   7. Нанесите 1 каплю карбоксиметилцеллюлозы натрия на роговицу, чтобы предотвратить пересыхание глаз.
2. Хирургическая имплантация
   1. Хирургическим скальпелем сделайте разрез 10 мм на голове по вертикальной средней линии между ушами.
   2. Сделайте разрез 5 мм на животе через слой кожи по средней линии ниже грудины.
   3. Проведите подкожно канюлю диаметром 5 мм от разреза брюшной полости к разрезу головки.
   4. Подайте электродные провода (3 активных и 3 неактивных) передатчика через канюлю от живота к голове.
   5. Оставьте электрод сравнения с основанием преобразователя и накройте наконечник электрода асептической марлей.
   6. Накройте наконечники электродов (3 активных и 3 неактивных) асептической марлей.
   7. Закрепите голову крысы на стереотаксической платформе.
   8. Хирургическими ножницами удлинейте разрез на лбу до 30 мм в длину.
   9. Обнажите операционную область, втянув дряблую кожу 2 швами (3 - 0) на ~ 3 и 9 часов.
   10. Соскребите надкостницу, расположенную над черепом, с помощью стерилизованной марли, чтобы обнажить брегмы, лямбды и срединные швы.
   11. Просверлите два отверстия в черепе по активным (7 мм вентрально к брегме, 3 мм латерально к средней линии) и неактивным (5 мм рострально до брегмы по средней линии) стереотаксическим координатам.
   12. Прикрепите активные и неактивные электроды VEP с помощью предварительно прикрепленных винтов из нержавеющей стали (диаметр 0,7 мм, длина 3 мм) к черепу с помощью небольшой отвертки на ~ 1 мм в глубину в предварительно сделанные отверстия. Таким образом, винт крепится к кости, не повреждая нижележащую кортикальную ткань.
   13. Чтобы имплантировать активные электроды ЭРГ, используйте шов 8 - 0, чтобы временно втянуть верхнее веко.
   14. Введите канюлю от 16 до 21 г подкожно из-за глаза до верхнего конъюнктивального свода.
   15. Снимите направляющую иглу.
   16. Подайте активный электрод через укороченный пластиковый катетер ото лба к глазу. Затем извлеките пластиковый катетер.
   17. Используйте временный шов (8 - 0), который продевается через петлю электрода, чтобы предотвратить втягивание электрода обратно в туннель.
   18. Сделайте разрез 0,5 мм на верхней конъюнктиве в положении «12 часов», на 1 мм позади лимба. Используйте тупое рассечение, чтобы обнажить нижележащую склеру.
   19. Имплантат 8 - 0 или 9 - 0 сразу за лимбом на половине толщины склеры.
   20. Снимите временный шов с активного электрода ЭРГ.
   21. Закрепите активный электрод ERG на шовной нити половинной толщины склеры, завязав 3 последовательных узла, убедившись, что кончик электрода расположен близко к лимбусу.
   22. Закройте лоскут конъюнктивы с помощью от 1 до 2 прерванных швов (от 8 - 0 до 9 - 0). Убедитесь, что конъюнктива полностью покрывает электрод ERG для повышения комфорта.
   23. Снимите отводящий век шов.
   24. Повторите процедуру для контралатерального глаза.
   25. Нанесите цианоакрилатный гель на череп, чтобы закрепить все нержавеющие винты и электродные провода. Перед фиксацией активных электродов ERG убедитесь, что они не натянуты слишком туго, чтобы обеспечить движения глаз.
   26. Закройте рану на голове нерассасывающимся швом 3 - 0
   .
   27. Поворачивайте грызуна, чтобы обнажить область живота. Хирургическими ножницами удлините дермальный разрез брюшной полости до 40 мм по белой линии.
   28. Сделайте разрез 35 мм через внутреннюю мышечную стенку, чтобы обнажить внутреннюю брюшную полость.
   29. С помощью двух швов (3 - 0) корпус трансмиттера прикрепляется к правой внутренней брюшной стенке животного. Избегайте контакта с печенью.
   30. Обмотайте заземляющий электрод петлей и закрепите его в такой форме швом (3 - 0). Затем поместите его свободно плавающим в брюшную полость.
   31. Закройте брюшину с помощью непрерывного шва (3 - 0).
   32. Закройте разрез кожи с помощью прерывистых швов (3 - 0).
3. Послеоперационный уход
   1. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной. После операции животное содержится поодиночке.
   2. Вводите карпрофен подкожно для обезболивания (5 мг/кг) один раз в сутки в течение 4 дней.
   3. Добавляйте профилактические пероральные антибиотики (Энрофлоксин, 5 мг/кг) в питьевую воду в течение 7 дней после операции.
   4. Нанесите противовоспалительную мазь на места разрезов кожи, чтобы уменьшить раздражение в течение первых 7 дней после операции.

3. Проведение записи ERG и VEP у сознательных крыс

1. Адаптация животного к темноте в течение 12 часов до записи ERG и VEP.
2. Все экспериментальные манипуляции проводить при тусклом красном освещении (17,4 кд.м-2, λmax = 600 нм)
3. Нанесите на роговицу местное обезболивание (0,5% проксиметакаин) и расширяющие (0,5% тропикамид) капли.
4. Направьте сознательного грызуна в специально изготовленный прозрачный ограничитель.
   заметка: Длина этой пластиковой трубки может быть отрегулирована для размещения крыс разного размера, при этом общий диаметр составляет 60 мм. Передняя часть устройства имеет коническую форму, чтобы свести к минимуму движение головы, и содержит перфорацию для обеспечения нормального дыхания. Эта коническая передняя часть обеспечивает выравнивание и стабилизацию головы и глаз крысы к отверстию сферы Ганцфельда. Обратите внимание, что грызун был акклиматизирован к ограничителю (от 3 до 5 раз) до операции.
5. Поместите грызуна перед миской Ганцфельда так, чтобы глаза были выровнены с отверстием миски.
6. Включите внутренний передатчик, пропустив магнит в пределах ~ 5 см от него. Затем убедитесь, что передатчик горит, проверив светодиодный индикатор состояния на основании приемника.
7. Собирайте сигналы в диапазоне световых энергий (т.е. от -5,6 до 1,52 log cd.s.m²).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Биоусилитель	Приложения	МЛ 135	Усиление сигналов ERG и VEP
Карбоксиметилцеллюлоза натрия 1,0%	Аллерган	КАС 0009000-11-7	Поддержание гидратации роговицы во время операции
Карпрофен 0,5%	Группа по охране здоровья животных Pfizer	КАС 53716-49-7	Послеоперационная анальгезия с инъекционным физиологическим раствором для восполнения жидкости
Хлоргексадин 0,5%	Лаборатории Ориона	27411, 80085	Дезинфекция хирургического инструмента
Активатор цианоакрилатного геля	Компоненты RS	473-439	Быстро высыхает цианоакрилатный гель
Цианоакрилатный гель	Компоненты RS	473-423	Крепление нержавеющих винтов к черепу
Зубные заусенцы	Storz Instruments, Bausch and Lomb	Е0824А	Миниатюрная сверлильная головка диаметром ~0,7 мм для проделывания небольшого отверстия в черепе над каждой полусферой для вживления винтов VEP
сверло	Бош	Серия Dremel 300	Автоматическая дрель для трепанации
Энрофлоксин	Лаборатории Трои		Профилактическое лечение антибиотиками после хирургического вмешательства
Интегрирующая сфера Ганцфельда	Фотометрические решения Интернэшнл		Специально разработанный световой стимулятор: диаметр 36 мм, размер апертуры 13 см
Марлевые тампоны	Мультигейт Медикал Продактс Пти Лтд	57-100В	Высушивает хирургический разрез и обнаженную поверхность черепа во время операции
Изофлуран 99,9%	Abbott Australasia Pty Ltd	КАС 26675-46-7	Фирменное наименование: Изофло (ТМ) Ингаляционный анестетик. Фармацевтический ингаляционный анестетик в смеси с газообразным кислородом для имплантации электродов VEP
Кенакомбская мазь	Аспен Фарма Пти Лтд		Для уменьшения раздражения кожи и зуда после операции
Светодиоды Luxeon	Филлипс Лайтинг Ко.		Для стимуляции света используются двадцать светодиодов мощностью 5 Вт и один светодиод мощностью 1 Вт, управляемые программным обеспечением Scope
Игла (макрохирургия)	Мировые прецизионные приборы	501959	для наложения швов на брюшную полость и голову, используется со швом 3-0, иглой с ушком, режущей кромкой 5/16 круга Размер 1, 15 мм
Иглодержатель (макрохирургия)	Мировые прецизионные приборы	500224	Для удержания иглы во время операций на брюшной полости и голове
Иглодержатель (микрохирургия)	Мировые прецизионные приборы	555419НТ	Держать иглу во время глазной хирургии
Катетер Optiva	Смитс Медикал Интернэшнл Лтд	16 или 21 г	Направляйте активные электроды роговицы от черепа к конъюнктиве
Повидон йод 10%	Санофи-Авентис	КАС 25655-41-8	Фирменное наименование: Бетадин, Антисептик для подготовки выбритой кожи к операции 10%, 500 мл
Система сбора данных Powerlab	Приложения	МЛ 785	Получение сигнала от телеметрического передатчика, сопряженного с преобразователем телеметрических данных
Проксиметакаин 0,5%	Лаборатории Alcon	КАС 5875-06-9	Местная глазная анальгезия
Ограничитель	Сделано Cutom		Передняя часть ограничителя сужается для минимизации движений головы, длина может быть отрегулирована в соответствии с разной длиной крысы, общий диаметр составляет 60 мм.
Отвал Scapel	Медицинские принадлежности R.G.	SNSM0206	Для хирургического разреза
Ножницы (макрохирургия)	Мировые прецизионные приборы	501225	для разрезания ткани на ягодицах и лбу
Ножницы (микрохирургия)	Мировые прецизионные приборы	501232	Рассечение конъюнктивы для крепления электродов
Программное обеспечение Scope	Приложения	Версия 3.7.6	Одновременная подача стимула через систему ADI Powerlab и сбор данных
электробритва	Остер	Золотой А5	Сбрейте шерсть с хирургических зон
Винты с полосами из нержавеющей стали	Микрокрепеж	Л001.003КС304	диаметр стержня 0,7 мм, длина 3 мм
Стереотаксическая рама	Дэвид Копф	Модель 900	Стереотаксический инструмент для небольших животных для определения местоположения ориентиров имплантации на черепе
Хирургическая простыня	Жизненно важные медицинские принадлежности	ГМ29-612ЭЭ	Обеспечьте стерильную среду во время операции
Наложение швов (макрохирургия)	Медицинские иглы Ninbo	3-0	для наложения швов на брюшную полость и голову, стерильная шелковая оплетка, 60см
Шовная игла (микрохирургия)	Медицинские иглы Ninbo	8-0 или 9-0	Для глазной хирургии, в том числе, наложение швов электрода на склеру и закрытие конъюнктивы, нейлоновый шовный материал, круг 3/8 1×5, 30 см
Преобразователь телеметрических данных	Международная организация «ДатаНьюенс Интернэ	Р08	Позволяет передавать сигнал телеметрии на сопряжение с программным обеспечением для сбора данных
Матрица обмена телеметрическими данными	Международная организация «ДатаНьюенс Интернэ		Собирает данные с передатчиков, сопряжен с приемником
Приемник телеметрических данных	Международная организация «ДатаНьюенс Интернэ	РПК-1	Получает данные телеметрии от передатчика
Передатчик телеметрии	Международная организация «ДатаНьюенс Интернэ	F50-EEE	3-х канальный передатчик телеметрии
Тропикамид 0,5%	Лаборатории Alcon		Дилатация радужной оболочки глаза
Пинцет (макрохирургия)	Мировые прецизионные приборы	500092	Манипуляции с тканями во время операций на брюшной полости и голове
Пинцет (микрохирургия)	Мировые прецизионные приборы	500342	Манипуляции с тканями во время глазной хирургии