Электроэнцефалографическая регистрация эпилептических припадков у крыс, вызванных эпилепсией

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Сборка зондового электродного устройства для микродиализа

1. Используйте 3-канальный двускрученный электрод (с длиной разреза регистрирующего электрода не менее 20 мм и заземляющим электродом длиной 10 см) и соедините его с направляющей канюлей для подготовки устройства. Смотрите примеры 3-канальных электродов и направляющей канюли для диализа на рисунке 1A-1B.
2. Извлеките (Рисунок 1C) и вставьте (Рисунок 1D) металлическую направляющую канюлю в фиктивную пластиковую канюлю несколько раз перед использованием, чтобы облегчить ее извлечение в момент переключения на микродиализный зонд у животного.
3. Дважды согните скрученные провода приводящего электрода (рисунок 1E-1F) для того, чтобы совместить провода с фиктивной канюлей направляющей, и отрежьте наконечник электрода (рисунок 1G) так, чтобы он был на 0,5 мм длиннее кончика направляющей канюли (рисунок 1H) с помощью цифрового штангенциркуля.
4. Подготовьте силиконовый кружок длиной 1 мм (наружный диаметр [Наружный диаметр] 2 мм, толщина 0,3 мм; Рисунок 1I) и вставьте наконечник направляющей канюли и кончик скрученных электродов в кремниевый круг с помощью пинцета (рисунок 1J). Закрепите его на ножке тумбы направляющей канюли с помощью полимерного клея быстрого действия или смолы (рисунок 1К). Примеры готовых устройств смотрите на рисунках 1L и 2A.
5. Стерилизуйте прибор под бактерицидным ультрафиолетовым (УФ) излучением в течение 4 ч. Переверните прибор четыре раза, чтобы каждая из его сторон подвергалась воздействию света в течение 1 ч.<бр/> заметка: Многие самодельные электроды и микродиализные зонды могут быть собраны аналогичным образом. Головка вышеописанного имплантата для крыс имеет следующие размеры: 7 мм ширина х 5 мм глубина х 10 мм длина от вершины до пьедестала пьедестала; Наконечник имплантата имеет длину около 11 мм, диаметр 600 мкм, а вес всего устройства составляет около 330-360 мг. Устройство может быть повторно использовано два или три раза, если (i) во время операции на черепе остается достаточная длина заземляющего электрода для следующего использования и (ii) когда животное убито, и устройство извлечено вместе со стоматологическим цементом, его оставляют в ацетоне на ночь, так что цемент может быть механически разукрупнен; И устройство снова промывают и стерилизуют.

2. Стереотаксическая хирургия

1. Используйте стереотаксический аппарат и держатель зажима для зонда (рис. 2B) для имплантации устройства в соответствии с современными стандартами асептических и безболезненных операций.
   1. Обезболите взрослых крыс Спрэг-Доули смесью кетамина/ксилазина (43 мг/кг и 7 мг/кг, внутрибрюшинно [в/в]) и закрепите ее на стереотаксическом каркасе. Добавьте изофлурановую анестезию (1,4% на воздухе; 1,2 мл/мин) к начальному введению кетамина/ксилазина, так как это позволяет контролировать глубину анестезии во времени. Сбрейте шерсть на голове животного.
2. Промокните поверхность кожи головы раствором на основе йода, а затем 70% этанолом, чтобы подготовить ее к асептической операции.
   1. Имплантат подготовленного в очереди (1,1 – 1,5) ведущего канюльно-электродного устройства осуществляется в правый вентральный гиппокамп с использованием следующих координат: носовая планка + 5,0 мм, А – 3,4 мм, L + 4,5 мм, Р + 6,5 мм до брегмы. Следуйте стандартным методикам стереотаксических операций.
   2. Следите за тем, чтобы он не закрывал анкерные винты. При установке его на стереотаксический аппарат возьмитесь за головку направляющей канюли, так как она может быть легко выровнена по держателю зонда.
3. Закрепите устройство на черепе не менее чем четырьмя нержавеющими винтами, вкрутив их в кость черепа (1 винт в левую и 1 винт в правую лобную костную пластину, 1 винт в левую теменную и 1 винт в межтеменные костные пластины). Добавьте каплю тканевого клея для дальнейшей фиксации каждого винта к кости черепа.
   1. Покройте половину резьбы винтов метакриловым цементом. Способствуйте связыванию цемента, делая неглубокие бороздки в кости для увеличения адгезии.
4. После того, как наконечник устройства будет расположен в ткани мозга, скрутите провод заземляющего электрода вокруг 3 анкерных винтов. Покройте все вмонтированные винты и аппарат стоматологическим цементом.
5. Наблюдайте за животными во время операции и в течение примерно 1 часа после нее, пока они не встанут в вертикальное положение и не начнут перемещаться по клетке. Держите их на грелке, чтобы избежать переохлаждения. Дайте крысам восстановиться в течение как минимум 7 дней после имплантации устройства.
6. Наблюдайте за животными не реже одного раза в день в течение 3 дней после операции на предмет признаков боли или дистресса. Для профилактики инфекции животным дают крем с антибиотиком (гентамицин 0,1%) близко к месту разреза и обезболивающее средство (трамадол 5 мг/кг, в/в) в течение 3 дней для предотвращения послеоперационной боли.

3. Индукция височной эпилепсии пилокарпином и распределение животных по экспериментальным группам

1. После недели послеоперационного восстановления случайным образом распределите животных по группам: (i) контрольные животные, получающие транспортное средство, и (ii) эпилептические животные, которые будут получать пилокарпин. Используйте пропорционально большее количество животных для группы эпилептиков, так как не у всех крыс, которым вводили пилокарпин, разовьется болезнь.
2. Введите дозу метилскополамина (1 мг/кг, подкожно [подкожно]) и через 30 минут после этого однократную инъекцию пилокарпина (350 мг/кг, внутримышечно) для индуцирования эпилептического статуса (СЭ). Введите метилскополамин и носитель (физиологический раствор) контрольным крысам. Используйте шприц объемом 1 мл с иглой 25G для всех внутримышечных введений.
   1. Визуально проверьте животных, чтобы у них начались поведенческие припадки (движение вибриссы в течение 5 минут, кивание головой, клонирование конечностей) и в течение 25 минут непрерывное клонирование всего тела (SE).
3. Остановка СЭ через 2 ч после начала заболевания приводит к смертности около 25% и среднему латентному периоду около 10 дней при введении диазепама (20 мг/кг, в/в). Наблюдайте и записывайте любые судороги, начинающиеся сразу после инъекции пилокарпина и продолжающиеся в течение не менее 6 часов после этого.
4. Вводите животным физиологический раствор (1 мл внутримышечно) с помощью шприца 1 мл с иглой 25G и раствором сахарозы (1 мл с пер.) с использованием шприца 1 мл и иглы для гибкого кормления 17G в течение 2-3 дней после СЭ для содействия восстановлению потери массы тела.
   1. Исключить из исследования животных, которые не достигли исходной массы тела в течение первой недели после пилокарпина СЭ (за исключением острой группы, погибшей через 24 ч после СЭ, где наблюдение за массой тела невозможно).
5. Животные после СЭ случайным образом распределены по различным экспериментальным группам (рис. 3): острая фаза (когда микродиализ происходит через 24 ч после СЭ), латентная (7-9 дней после СЭ), первый спонтанный приступ (примерно через 11 дней после СЭ) и хронический период (начинается примерно через 22-24 дня после СЭ, т.е. примерно через 10 дней после первого припадка). Следите за животными на предмет возникновения спонтанных припадков.
   заметка: Для дальнейших экспериментов на крысах-эпилептиках используйте следующие критерии включения/исключения: развитие судорожной СЭ в течение 1 ч после введения пилокарпина; увеличение массы тела в первую неделю после СЭ и правильное позиционирование микродиализного зонда и электрода.

4. Мониторинг и анализ эпилептического поведения

1. Долгосрочный мониторинг эпилептического поведения
   1. Примерно через 6 ч после введения пилокарпина (т.е. по окончании непосредственного наблюдения со стороны исследователей) поместите животных в чистые домашние клетки и начните 24-часовое видеонаблюдение.
   2. Продолжайте 24-часовой видеомониторинг до 5 дня с использованием цифровой системы видеонаблюдения.
   3. Начиная с 5-го дня, подключите крыс в прямоугольных клетках к привязной системе регистрации ЭЭГ и продолжайте 24-часовой видеомониторинг.
   4. Установите параметры на усилителе, расположенном за пределами клетки Фарадея (установите коэффициент усиления на каждом канале в соответствии со спецификой сигнала ЭЭГ каждого отдельного животного) и начните сбор данных ЭЭГ, наблюдая за сигналом ЭЭГ, производимым неподключенными кабелями. Используйте частоту дискретизации 200 Гц и фильтр нижних частот, установленный на 0,5 Гц.
   5. Подключите животное к кабелям, удерживая голову животного между двумя вытянутыми пальцами одной руки, а другой свободной рукой прикрутите разъемы к пьедесталу электрода. Начать приобретение.
      осторожность: Убедитесь, что сигнал не содержит артефактов. Обычными артефактами являются шипы, значительно превышающие масштаб.
   6. За сутки до эксперимента с микродиализом переведите животных в привязную систему ЭЭГ, оснащенную цилиндрами из плексигласа для микродиализа. Отключите животных от привязной системы ЭЭГ в домашней клетке, закрутив разъемы от электрода, не удерживая животное. Поместите животное в высокие цилиндры из плексигласа.

Рисунок 1. Пошаговая подготовка устройства к имплантации. (А) 3-канальный электрод с заземляющим электродом длиной 10 см в защитной втулке слева и направляющей канюлей для микродиализа справа, необходимой для сборки устройства. (B). Неизолированный электрод и направляющая канюля в деталях. Первым шагом является извлечение (C) и вставка (D) металлической направляющей канюли из пластикового манекена и в него несколько раз, чтобы облегчить ее освобождение после имплантации в голову животного. Второй шаг заключается в том, чтобы дважды согнуть скрученный регистрирующий электрод, который должен быть выровнен с направляющей канюлей диализа (E, F). (G) Наконечник электрода должен быть обрезан так, чтобы он был на 0,5 мм длиннее кончика металлической направляющей канюли. (H) Проверьте точность реза с помощью цифрового штангенциркуля. Затем с помощью силиконового кольца длиной около 1 мм следует зафиксировать выравнивание электрода по направляющей лапке канюли (I). (J) Фотография, показывающая, как кольцевать электрод и направлять вал канюли. Завершающим этапом является нанесение капли смолы или клея на тумбу направляющей канюли, закрепив к ней силиконовый обруч (К). (L) Собранное устройство готово к стерилизации.

Рисунок 2. Фотографии различных типов устройств для микродиализа-ЭЭГ у крыс, использованных (А) и фотография держателя зажима зонда (В), используемого для имплантации этих устройств. (A) Направляющая канюля (зеленого цвета) заменяется канюлей для микродиализа, как правило, за 24 ч до эксперимента. Электрический разъем устройства (первый слева использовался для записей, описанных в данной рукописи) позволяет подключать провода, проводящие электрический сигнал к усилителю и оборудованию для сбора данных. Устройство хирургическим путем прикрепляется к черепу крыс под наркозом, и записи могут быть получены позже, не вызывая боли или дискомфорта у свободно ведущих себя крыс.

Рисунок 3. Экспериментальный дизайн. За неделю до индукции эпилептического статуса (СЭ) крысам имплантируют устройство. СЭ индуцируется пилокарпином, и животные (если они не были диализированы и умерщвлены через 24 ч после СЭ; крысы из острой группы) находятся под видеонаблюдением в течение 5 дней (синяя линия), а затем контролируются видео-ЭЭГ для оценки частоты и продолжительности приступов в домашних клетках (зеленая линия). Для эксперимента с микродиализом крысы с эпилепсией и соответствующие крысы контрольной группы, не получавшие эпилепсии, за 24 часа до сеанса микродиализа переводят на другую ЭЭГ-установку, оборудованную цилиндрическими клетками и по-прежнему контролируемую видео-ЭЭГ (светло-зеленая линия). Вертикальными красными линиями обозначены сеансы диализа в разные сроки развития эпилептического заболевания. Горизонтальные красные линии представляют различные группы эпилептических животных (и соответствующих неэпилептических животных), где стрелка указывает на последний день микродиализа и день смерти животного.