Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Сборка зондового электродного устройства для микродиализа
- Используйте 3-канальный двускрученный электрод (с длиной разреза регистрирующего электрода не менее 20 мм и заземляющим электродом длиной 10 см) и соедините его с направляющей канюлей для подготовки устройства. Смотрите примеры 3-канальных электродов и направляющей канюли для диализа на рисунке 1A-1B.
- Извлеките (Рисунок 1C) и вставьте (Рисунок 1D) металлическую направляющую канюлю в фиктивную пластиковую канюлю несколько раз перед использованием, чтобы облегчить ее извлечение в момент переключения на микродиализный зонд у животного.
- Дважды согните скрученные провода приводящего электрода (рисунок 1E-1F) для того, чтобы совместить провода с фиктивной канюлей направляющей, и отрежьте наконечник электрода (рисунок 1G) так, чтобы он был на 0,5 мм длиннее кончика направляющей канюли (рисунок 1H) с помощью цифрового штангенциркуля.
- Подготовьте силиконовый кружок длиной 1 мм (наружный диаметр [Наружный диаметр] 2 мм, толщина 0,3 мм; Рисунок 1I) и вставьте наконечник направляющей канюли и кончик скрученных электродов в кремниевый круг с помощью пинцета (рисунок 1J). Закрепите его на ножке тумбы направляющей канюли с помощью полимерного клея быстрого действия или смолы (рисунок 1К). Примеры готовых устройств смотрите на рисунках 1L и 2A.
- Стерилизуйте прибор под бактерицидным ультрафиолетовым (УФ) излучением в течение 4 ч. Переверните прибор четыре раза, чтобы каждая из его сторон подвергалась воздействию света в течение 1 ч.<бр/>
заметка: Многие самодельные электроды и микродиализные зонды могут быть собраны аналогичным образом. Головка вышеописанного имплантата для крыс имеет следующие размеры: 7 мм ширина х 5 мм глубина х 10 мм длина от вершины до пьедестала пьедестала; Наконечник имплантата имеет длину около 11 мм, диаметр 600 мкм, а вес всего устройства составляет около 330-360 мг. Устройство может быть повторно использовано два или три раза, если (i) во время операции на черепе остается достаточная длина заземляющего электрода для следующего использования и (ii) когда животное убито, и устройство извлечено вместе со стоматологическим цементом, его оставляют в ацетоне на ночь, так что цемент может быть механически разукрупнен; И устройство снова промывают и стерилизуют.
2. Стереотаксическая хирургия
- Используйте стереотаксический аппарат и держатель зажима для зонда (рис. 2B) для имплантации устройства в соответствии с современными стандартами асептических и безболезненных операций.
- Обезболите взрослых крыс Спрэг-Доули смесью кетамина/ксилазина (43 мг/кг и 7 мг/кг, внутрибрюшинно [в/в]) и закрепите ее на стереотаксическом каркасе. Добавьте изофлурановую анестезию (1,4% на воздухе; 1,2 мл/мин) к начальному введению кетамина/ксилазина, так как это позволяет контролировать глубину анестезии во времени. Сбрейте шерсть на голове животного.
- Промокните поверхность кожи головы раствором на основе йода, а затем 70% этанолом, чтобы подготовить ее к асептической операции.
- Имплантат подготовленного в очереди (1,1 – 1,5) ведущего канюльно-электродного устройства осуществляется в правый вентральный гиппокамп с использованием следующих координат: носовая планка + 5,0 мм, А – 3,4 мм, L + 4,5 мм, Р + 6,5 мм до брегмы. Следуйте стандартным методикам стереотаксических операций.
- Следите за тем, чтобы он не закрывал анкерные винты. При установке его на стереотаксический аппарат возьмитесь за головку направляющей канюли, так как она может быть легко выровнена по держателю зонда.
- Закрепите устройство на черепе не менее чем четырьмя нержавеющими винтами, вкрутив их в кость черепа (1 винт в левую и 1 винт в правую лобную костную пластину, 1 винт в левую теменную и 1 винт в межтеменные костные пластины). Добавьте каплю тканевого клея для дальнейшей фиксации каждого винта к кости черепа.
- Покройте половину резьбы винтов метакриловым цементом. Способствуйте связыванию цемента, делая неглубокие бороздки в кости для увеличения адгезии.
- После того, как наконечник устройства будет расположен в ткани мозга, скрутите провод заземляющего электрода вокруг 3 анкерных винтов. Покройте все вмонтированные винты и аппарат стоматологическим цементом.
- Наблюдайте за животными во время операции и в течение примерно 1 часа после нее, пока они не встанут в вертикальное положение и не начнут перемещаться по клетке. Держите их на грелке, чтобы избежать переохлаждения. Дайте крысам восстановиться в течение как минимум 7 дней после имплантации устройства.
- Наблюдайте за животными не реже одного раза в день в течение 3 дней после операции на предмет признаков боли или дистресса. Для профилактики инфекции животным дают крем с антибиотиком (гентамицин 0,1%) близко к месту разреза и обезболивающее средство (трамадол 5 мг/кг, в/в) в течение 3 дней для предотвращения послеоперационной боли.
3. Индукция височной эпилепсии пилокарпином и распределение животных по экспериментальным группам
- После недели послеоперационного восстановления случайным образом распределите животных по группам: (i) контрольные животные, получающие транспортное средство, и (ii) эпилептические животные, которые будут получать пилокарпин. Используйте пропорционально большее количество животных для группы эпилептиков, так как не у всех крыс, которым вводили пилокарпин, разовьется болезнь.
- Введите дозу метилскополамина (1 мг/кг, подкожно [подкожно]) и через 30 минут после этого однократную инъекцию пилокарпина (350 мг/кг, внутримышечно) для индуцирования эпилептического статуса (СЭ). Введите метилскополамин и носитель (физиологический раствор) контрольным крысам. Используйте шприц объемом 1 мл с иглой 25G для всех внутримышечных введений.
- Визуально проверьте животных, чтобы у них начались поведенческие припадки (движение вибриссы в течение 5 минут, кивание головой, клонирование конечностей) и в течение 25 минут непрерывное клонирование всего тела (SE).
- Остановка СЭ через 2 ч после начала заболевания приводит к смертности около 25% и среднему латентному периоду около 10 дней при введении диазепама (20 мг/кг, в/в). Наблюдайте и записывайте любые судороги, начинающиеся сразу после инъекции пилокарпина и продолжающиеся в течение не менее 6 часов после этого.
- Вводите животным физиологический раствор (1 мл внутримышечно) с помощью шприца 1 мл с иглой 25G и раствором сахарозы (1 мл с пер.) с использованием шприца 1 мл и иглы для гибкого кормления 17G в течение 2-3 дней после СЭ для содействия восстановлению потери массы тела.
- Исключить из исследования животных, которые не достигли исходной массы тела в течение первой недели после пилокарпина СЭ (за исключением острой группы, погибшей через 24 ч после СЭ, где наблюдение за массой тела невозможно).
- Животные после СЭ случайным образом распределены по различным экспериментальным группам (рис. 3): острая фаза (когда микродиализ происходит через 24 ч после СЭ), латентная (7-9 дней после СЭ), первый спонтанный приступ (примерно через 11 дней после СЭ) и хронический период (начинается примерно через 22-24 дня после СЭ, т.е. примерно через 10 дней после первого припадка). Следите за животными на предмет возникновения спонтанных припадков.
заметка: Для дальнейших экспериментов на крысах-эпилептиках используйте следующие критерии включения/исключения: развитие судорожной СЭ в течение 1 ч после введения пилокарпина; увеличение массы тела в первую неделю после СЭ и правильное позиционирование микродиализного зонда и электрода.
4. Мониторинг и анализ эпилептического поведения
- Долгосрочный мониторинг эпилептического поведения
- Примерно через 6 ч после введения пилокарпина (т.е. по окончании непосредственного наблюдения со стороны исследователей) поместите животных в чистые домашние клетки и начните 24-часовое видеонаблюдение.
- Продолжайте 24-часовой видеомониторинг до 5 дня с использованием цифровой системы видеонаблюдения.
- Начиная с 5-го дня, подключите крыс в прямоугольных клетках к привязной системе регистрации ЭЭГ и продолжайте 24-часовой видеомониторинг.
- Установите параметры на усилителе, расположенном за пределами клетки Фарадея (установите коэффициент усиления на каждом канале в соответствии со спецификой сигнала ЭЭГ каждого отдельного животного) и начните сбор данных ЭЭГ, наблюдая за сигналом ЭЭГ, производимым неподключенными кабелями. Используйте частоту дискретизации 200 Гц и фильтр нижних частот, установленный на 0,5 Гц.
- Подключите животное к кабелям, удерживая голову животного между двумя вытянутыми пальцами одной руки, а другой свободной рукой прикрутите разъемы к пьедесталу электрода. Начать приобретение.
осторожность: Убедитесь, что сигнал не содержит артефактов. Обычными артефактами являются шипы, значительно превышающие масштаб.
- За сутки до эксперимента с микродиализом переведите животных в привязную систему ЭЭГ, оснащенную цилиндрами из плексигласа для микродиализа. Отключите животных от привязной системы ЭЭГ в домашней клетке, закрутив разъемы от электрода, не удерживая животное. Поместите животное в высокие цилиндры из плексигласа.
