Регистрация возбуждающих постсинаптических потенциалов нейронного поля в острых срезах гиппокампа

Аннотация

Источник: Weng, W., et al. Запись синаптической пластичности в острых срезах гиппокампа, поддерживаемых в камерной системе малого объема для переработки, перфузии и погружения. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует процедуру установки среза мозга в погружной камере для записи синаптической активности. Процесс включает в себя закрепление среза на линзовой бумаге, поддержание непрерывного потока искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) для обеспечения жизнеспособности нейронов, а также точное позиционирование электродов для стимуляции и записи относительно определенной области мозга, представляющей интерес. Эта установка позволяет точно контролировать исходную синаптическую активность и эффекты электрической стимуляции.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Запись синаптических откликов в камере для погружения

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу материалов.

1. Предварительно подогрейте раствор aCSF на водяной бане примерно до 28-30 °C (это предотвратит образование пузырьков в камере записи).
2. Запустите систему рециркуляции (4-5 мл/мин) и активируйте встроенный нагреватель для балансировки системы не менее чем на 1 ч.
3. Предварительно замочите небольшой кусочек бумаги для чистки объектива и капроновую сетку, закрепленную на U-образной платиновой проволоке, в камере для погружения на несколько минут (рис. 1).
4. Снимите U-образную платиновую проволоку.
5. Выключите переработку и положите ломтик на бумагу для чистки объектива.
6. Немедленно поместите сетку для удержания среза поверх среза, включите насос и дайте срезу уравновеситься в течение 30 минут, не погружая объектив в аCSF.
7. Заполните боросиликатную микропипетку (т.е. записывающий электрод) aCSF (сопротивление наконечника: 1-2 МОм, заполнено на 1/3 aCSF) и установите ее в держатель пипетки.
8. Поместите испытанный вольфрамовый электрод с эпоксидной изоляцией в держатель манипулятора, а провода сравнения — в камеру среза.
9. Добавьте второй электрод сравнения в камеру и подключите его к контрольному гнезду головного столика записывающего электрода (рис. 1A).
10. В программном обеспечении для управления усилителем нажмите на поле «режим нулевого зажима» и продолжите, дважды кликнув по полю «список выходного усиления». Выберите коэффициент усиления «100», дважды щелкните «Список фильтров высоких частот (по Бесселю)», выберите «0,1 Гц» и дважды щелкните «Список фильтров низких частот (AC)», чтобы выбрать «3 кГц».
11. В программном обеспечении для записи нажмите на кнопку "Приобрести | Open Protocol (Открытый протокол)." Выберите протокол, который имеет настройки, позволяющие выполнять эпизодическую стимуляцию и оцифровку усиленных потенциалов на частоте 10-20 кГц в течение 50-100 мс, и который автоматически запускает изолятор стимулов через 10 мс после начала эпизодической записи.
12. Разместите электроды стимуляции и записи на одной линии и параллельно пирамидальному слою, например, (Рисунок 1B и Рисунок 2).
13. Нажмите "Приобрести | Редактировать протокол» и выберите вкладку «триггер» (во всплывающем окне). Нажмите на поле «Источник триггера» и выберите «пробел» в качестве источника триггера. Нажмите кнопку «ОК». Нажмите кнопку «Запись», чтобы начать захват и обратите внимание на всплывающее окно с триггерной кнопкой.
14. В программном обеспечении изолятора стимулов нажмите на поле «контроль напряжения» и введите «0». Нажмите кнопку «скачать». Нажмите на окно «Программа для записи» и нажмите пробел. Повторите этот цикл, последовательно вводя значения от 1 до 8, например, с шагом 1 мВ в поле «контроль напряжения».
15. Соотнесите силу стимуляции со значениями наклона fEPSP и определите необходимую силу стимуляции для получения 40% от максимума наклона fEPSP. Нажмите на «поле управления напряжением» и введите определенное значение. Нажмите кнопку "скачать".
    заметка: Изолятор стимулов используется для подачи кратковременных импульсов напряжения или тока на ткани мозга. Двухфазные импульсы могут иметь 100 мкс на фазу.
16. В программном обеспечении для записи нажмите кнопку «Стоп», а затем меню «Приобретение». Нажмите «Редактировать протокол» и выберите вкладку «Триггер» во всплывающем окне. Нажмите на поле источника триггера и выберите «внутренний таймер» в качестве источника триггера. Нажмите кнопку «ОК». Например, нажмите кнопку записи, которая запускает автоматическую запись потенциалов поля каждые 30 с. Нажмите кнопку «стоп» через 30-60 минут.
17. Нажмите на меню «Получить», нажмите на «Открыть протокол», выберите нужный протокол индукции синаптической пластичности и нажмите кнопку «ОК». Нажмите кнопку «запись», чтобы автоматически активировать высокочастотную стимуляцию и запись. Нажмите кнопку "стоп".
    заметка: В случае исследований, связанных с синаптической пластичностью, примените одну из стандартных индукционных парадигм для долгосрочного потенцирования или долгосрочной депрессии после длительной исходной записи. Репрезентативные примеры результирующей модуляции синаптической передачи изображены на рисунках 4 и 5.
18. В программном обеспечении для записи нажмите «Приобрести | Открыть протокол» и выбрать тот же протокол, что и в шаге 4.12. Нажмите кнопку "ОК", а затем нажмите "запись." Продолжайте автоматически запускать поле потенциальных записей, например, в течение 2-4 часов. Нажмите кнопку «стоп», чтобы прервать запись.
19. В случае фармацевтических исследований применяйте соединение непосредственно в резервуаре с ФКБ, если требуется постоянное введение соединения (Рисунок 3).

Результаты

Рисунок 1: Компоненты оттока-карбогенации для экспериментов в погружной камере среза. (А) Презентация погружной камеры для среза. Изображена U-образная платиновая проволока с нейлоновыми волокнами, удерживающая разрез гиппокампа. Серебряные провода были обернуты вокруг небольшой канюли, создавая катушку для увеличения площади окончания серебряной проволоки. Опорный провод для стимуля...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Электрофизиологическое оборудование и материалы
Вертикальный съемник пипеток	Нарисигэ, Япония	ПК-10
Виброизоляционный стол	Мейритс, Япония	АДЗ-А0806
Записывающая камера погружного типа	Уорнер Инструментс	RC-26GLP
Термостатическая водяная баня	Чжунчэн Ици, Китай	НЧ-1
4-осевой микроманипулятор	Саттер, США	МП-285, МП-225
Платиновая проволока	Мировые прецизионные приборы	ПТП406
усилитель	Молекулярные приборы, США	Мультизажим 700B
Система сбора данных	Молекулярные приборы, США	Digidata 1440А
Программное обеспечение Anaysis	Молекулярные приборы, США	Зажим 10.2
Флуоресцентный микроскоп	Nikon, Япония	ФН1
Светодиодный источник света	Lumen Dynamics Group, Канада	X-cite 120LED
Микропипетки	Гарвардский аппарат	GC150TF	внесотовая запись
Боросиликатные микропипетки	Саттер, США	БФ150-86	Патч Хомут
Вольфрамовый электрод	A-M Systems, США	No 575500
Перистальтический насос	Лонгер, Китай	БТ00-300Т
Трубки для перистальтического насоса	ISMATEC, Вертхайм, Германия	СК0309	1x вход, ID: 1.02мм
Трубки для перистальтического насоса	ISMATEC, Вертхайм, Германия	СК0319	2x трубки для вытока, ID: 2,79 мм
ПЗС-камера	PCO, Германия	pco.edge sCMOS
Бумага для чистки объектива	кодак
Коническая центрифужная пробирка 50 мл	Термонаучная	339652
Предкамерный	Уорнер Инструментс	БСК-ПК
Встроенный нагреватель	Уорнер Инструментс	СФ-28
Регулятор температуры	Уорнер Инструментс	ТК-324Б
Требуются реагенты
NaCl	Химический реагент Sinopharm, <бр /> Китай	10019318
KCl	Химический реагент Sinopharm, <бр /> Китай	10016318
КХ2ГО4	Химический реагент Sinopharm, <бр /> Китай	10017618
MgCl2,6H 2O	Химический реагент Sinopharm, <бр /> Китай	10012818
CaCl2	Химический реагент Sinopharm, <бр /> Китай	10005861
НаОГС3	Химический реагент Sinopharm, <бр /> Китай	10018960
глюкоза	Химический реагент Sinopharm, <бр /> Китай	10010518
2PO4	Химический реагент Sinopharm, <бр /> Китай	20040718
ХЕПЕС	сигма	Н3375
Пируват натрия	сигма	А4043
MgSO4	Химический реагент Sinopharm, <бр /> Китай	20025118
НаОХ	Химический реагент Sinopharm, <бр /> Китай	10019718