Электрофизиологическая регистрация препаратов ствола головного мозга и спинного мозга от новорожденного грызуна

Аннотация

Источник: Rousseau, J., et al. Электрофизиология изолированных препаратов ствола головного мозга и спинного мозга новорожденных грызунов позволяет записывать выходные данные нейронной дыхательной сети. J. Vis. Exp. (2015).

Это видео демонстрирует электрофизиологические записи изолированных препаратов ствола головного мозга и спинного мозга новорожденных грызунов. Препарат помещают в регистрирующую камеру, а всплески вдоха из ствола мозга регистрируются в условиях насыщения кислородом и недостатка кислорода с помощью четвертого вентрального нервного корешка в спинном мозге.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Настройка и подготовка

1. Решения
   1. Приготовьте исходные растворы искусственной спинномозговой жидкости (аКСФ) по следующим рецептам. Другие рецепты с вариациями концентрации доступны в литературе. Храните исходные растворы при температуре 4 °C до одного месяца.
      1. Раствор соли: добавить 75,39 г NaCl (129 мМ конечный); 2,5 г KCl (3,35 мМ конечный); 0,81 г₂PO4 (0,58 мМ конечный); 2,33 г MgCl₂ (1,15 мМ конечный); 1,85 г CaCl₂ (1,26 мМ). Растворите в 800 мл дистиллированной воды, затем заполните до 1 л дистиллированной водой.
      2. Раствор гидрокарбоната: добавить 17,65 г NaHCO₃ (21 мМ конечный). Растворите в 900 мл дистиллированной воды, затем наполните до 1 л дистиллированной водой. Изменения концентрации бикарбоната приведут к изменениям pH.
      3. Раствор глюкозы: добавить 54,06 г глюкозы (30 мМ конечный). Растворите в 400 мл дистиллированной воды, затем залейте до 500 мл дистиллированной водой.
   2. Приготовьте aCSF, разбавив 100 мл раствора соли, 100 мл раствора бикарбоната и 50 мл раствора глюкозы в 1 л дистиллированной воды. Хранить при температуре 4 °C до использования.
   3. Подготовьте стеклянный электрод, согрев и растянув стеклянную трубку до тех пор, пока она не разобьется. Перед использованием отшлифуйте кончик. Электрод можно использовать многократно, если он остается чистым.
2. Экспериментальная установка
   заметка: Детали настройки представлены на рисунке 1.
   1. Включите усилитель, скользящий усреднитель, систему сбора данных, регулятор температуры и насос. Проверьте усиление сигнала (коэффициент усиления = 10 000), фильтрацию (нижний порог, 10 Гц; верхний порог, 5 кГц) и частоту дискретизации аналогово-цифрового преобразования исходного сигнала (2,5 кГц).
   2. Наполните бутылку аCSF и наполните ее карбогеном (95%_О2, 5%_СО2). Индуцируйте поток пузырьков и подогретых aCSF в записывающей камере (объем 5 мл) со скоростью 4 мл/мин. Поддерживайте температуру в записывающей камере на уровне 26 (± 1) °C. pH должен быть 7,4 в этих стандартных условиях.
   3. Храните 50 мл аКСФ комнатной температуры (ОТ) и карбоген-пузырьков в шприце объемом 50 мл рядом с камерой вскрытия.
   4. Включите компьютер и запустите программу записи.

2. Вскрытие

1. Взвесьте и визуально определите пол животного (самцы имеют более длинное аногенитальное расстояние, в то время как самки имеют короткое аногенитальное расстояние; мужские гениталии часто темные, в то время как женские гениталии розовые).
2. Обезболить новорожденных грызунов можно одним из следующих вариантов: криоанестезия (полное погружение животного в лед на 4 – 5 мин), инъекция (эквитензина в дозе 4 мл/кг) или ингаляция летучих анестетиков (изофлурана или эфира). Подтвердите адекватную плоскость анестезии отсутствием рефлекса отведения лапы.
3. Поместите животное на скамейку брюшной лицевой стороной вниз. Рассекайте ростральную часть головы коронально скальпелем на уровне брегмы (видно через кожу и череп). Выполняйте этот этап сразу после того, как животное будет обезболито.
4. Разрез тела коронально скальпелем под передними членами.
5. Удалите кожу, мышцы, жировые ткани и вискус хирургическими и тонкими ножницами и плоскогубцами. Так как кости в этом возрасте мягкие, будьте осторожны, чтобы не повредить нервную систему. Выполните этот шаг на скамейке.
6. Поместите препарат в камеру для вскрытия. Используйте кислотномозговую жидкость, хранящуюся в шприце, для насыщения препарата кислородом. С этого момента и до конца записи используйте микроскоп.
7. На тыльной поверхности препарата разрежьте череп и позвонки от ростральной до каудальной части по средней оси хирургическими и тонкими ножницами и плоскогубцами. Вскрыть разрезанный череп и позвонки для того, чтобы обнажить нервную ткань. Используйте кислотномозговую жидкость, хранящуюся в шприце, для насыщения препарата кислородом.
8. Плоскогубцами удалите паутинную оболочку, тонкую ткань, покрывающую поверхность нервной ткани. Удерживают мягкую мозговую оболочку и кровеносные сосуды против нервной ткани. Используйте кислотномозговую жидкость, хранящуюся в шприце, для насыщения препарата кислородом.
9. Положите препарат тыльной стороной вниз и осторожно опустите ствол головного мозга и спинной мозг, разрезая ножницами нервы и соединительную ткань, удерживая препарат на месте. Также возможен дорсальный доступ. Сохраняйте корни и нервы как можно дольше. Удалите кости, чтобы изолировать ствол головного мозга и спинной мозг. Используйте кислотномозговую жидкость, хранящуюся в шприце, для насыщения препарата кислородом.
10. Удалите мозжечок и оставшиеся ростральные структуры, разрезав их скальпелем. Используйте аCSF, хранящийся в игле, для насыщения препарата кислородом.
11. По желанию, в зависимости от плана эксперимента, удалите мост с помощью скальпеля корональным разрезом перед нижней мозжечковой артерией. Обратите внимание, что сохранение целого моста замедлит ритм у крыс и полностью подавит его у мышей. Препараты, включающие только каудальную часть моста, проявляют дыхательную активность со стабильной частотой в корне С4.

3. Запись

1. Поместите препарат в камеру записи брюшной стороной вверх. Закрепите препарат булавками в самом нижнем отделе спинного мозга и ростральном отделе ствола мозга.
2. С помощью шприца, соединенного с электродом иглой, вызвать углубление в электроде (диаметр стеклянного наконечника: 150 - 225 мкм) путем вытягивания поршня шприца, чтобы частично заполнить электрод aCSF.
3. С помощью микроманипулятора аккуратно расположите электрод вплотную к одному из четвертых вентральных корешков. Другие вентральные корешки также могут проявлять дыхательную активность (например, XII черепной нерв, С1 вентральный корешок).
4. Вызовите углубление в резервуаре электрода с помощью шприца, вытянув поршень, чтобы мягко аспирировать нервный корешок. Затем осторожно переместите электрод, чтобы приложить его к спинному мозгу.
   заметка: В идеале размер корешка совпадает с размером отверстия электрода и, таким образом, создается уплотнение между внутренним и внешним отсеками электрода. Поскольку для такой записи обычно используются дифференциальные усилители, любое отверстие между внутренней частью электрода и камерой записи снижает качество сигнала и затрудняет устранение фонового шума.
5. Запустите запись.
6. Запишите ритм, производимый препаратом в нормоксических условиях (т.е. при пузырчатом использовании аКСФ с карбогеном: 95%_О2 и 5% СО2) в течение не менее 20 минут для определения исходных параметров препарата.
7. Переключите перфузию с карбоген-пузырькового aCSF на стимульный aCSF (т.е. пузырьковый с 95%_N2 и 5% CO2 для стимуляции гипоксии) на 15 мин. Изменяйте продолжительность воздействия в зависимости от протокола эксперимента. Запишите продолжительность воздействия на запись и в паспорт животного. По возможности используйте трубки из нержавеющей стали между баллоном aCSF и камерой, чтобы избежать диффузии газа наружу трубки.
8. Переключите перфузию обратно на стандартный карбоген-пузырьковый aCSF не менее чем на 15 минут для записи восстановления. Запишите это в протоколе и паспорте животного.
9. Завершите запись.

Результаты

Рисунок 1. Рекомпитулятивная схема установки.Пузырьковый aCSF нагревается и направляется насосом в записывающую камеру. Избыток aCSF в записывающей камере отсасывается насосом и утилизируется. Регистрирующая камера связана с землей и регулятором температуры. Выход электрода напрямую передается на усилитель, затем на скользящий усреднитель и систему сбора данных, и, наконец, на компьютер.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сильгард	Сигма Олдрич	761036-5ЭА	Использование под капотом
NaCl	Биошоп	СОД002
KCl	Биошоп	ПК888
CaCl2	Биошоп	ССЛ444
MgCl2	Биошоп	МАГ510
НаОГС3	Биошоп	СОБ999
2PO4	Биошоп	СПМ306
D-глюкоза	Биошоп	GLU501
Карбоген	Компания Linde	343-02-0006 (Английский
Регулятор температуры	Warner Instruments, Хамден, Коннектикут, США	ТК-324Б
Всасывающий электрод	A-M Systems, Эверетт, штат Вашингтон, США	модель 573000
Дифференциальный усилитель переменного тока	A-M Systems, Эверетт, штат Вашингтон, США	Модель 1700
Скользящий усредненный	CWE, Ардмор, Пенсильвания, США	модель МА-821
Система сбора данных	Dataq Instruments, Акрон, Огайо, США	модель DI-720
Программное обеспечение LabChart	Адинструментс, Колорадо-Спрингс, Колорадо, США
Программное обеспечение Prism	Graphpad, Ла-Хойя, Калифорния, США
Записывающая камера	Домашнее изготовление
основа	Kanetec, Бенсенвилль, Иллинойс, США
микроманипулятор	World Precision Instrument Inc, Сарасота, Флорида, США	Мб
основа	Kanetec, Бенсенвилль, Иллинойс, США	КАЙТ-Р
Перистальтический насос	Гилсон, Миддлтон, штат Висконсин, США	Мб
Клетка Фарадея	Домашнее изготовление	МИНИПУЛЬС 3
компьютер

)