Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка к операции
- Очистите и подготовьте трансмиттер, чтобы обеспечить безопасную и стерильную операцию. Извлеките передатчик из антистатической упаковки и распылите или замочите в 70% этаноле. Промойте трансмиттер стерильным физиологическим раствором и поместите между стерильными ватными губками, смоченными в стерильном физрастворе, или погрузите его в стерильный физиологический раствор.
- Сбор и стерилизация инструментов, необходимых для проведения операции, паровой автоклав для стерилизации. Список хирургических инструментов см. в таблице материалов и реагентов.
2. Хирургическая имплантация
- Обезболивайте животных и поддерживайте анестезию в соответствии с протоколом, одобренным IACUC. В начале и во время операции проверяйте пальцево-щипковый рефлекс каждые 15 минут. Отсутствие ответной реакции свидетельствует о достаточном уровне анестезии.
- Для щенков используют анестезию изофлураном (4%) сО2 (100%). Взрослым следует применять кетамин (100 мг/кг) с ксилазином (10 мг/кг).
- Фиксация положения в стереотаксической раме. Поместите ушные планки в слуховой проход. Не затягивайте слишком сильно ушные рамки, так как череп очень мягкий у молодых крысят. Закрепите носовой конус для анестезии.
- Согрейте животное во время операции, положив его на грелку, установленную на 37 °C. Взрослым животным наносят смазывающую мазь на глаза животного.
- Стерилизуйте место разреза и поддерживайте стерильность операционного поля.
- Смойте кожу головы чередующимся нанесением 70% этанола и бетадина. Начните с центра кожи головы и делайте все более широкие концентрические круги.
- Накройте животное простыней и проведите операцию над задрапированным животным. Поддерживайте стерильность операционного поля, облицовывая хирургическую установку стерильными простынями, распыляя оборудование с 70% этанолом.
- Надевайте стерильные хирургические перчатки и халат (или по требованию учреждения). Чтобы помочь сохранить стерильное поле, используйте хирургического ассистента.
- Сделайте надрез на волосистой части головы животного немного за глазами по средней линии, примерно на 2 см. Будьте осторожны при введении скальпеля, так как у молодых крыс череп еще очень мягкий. Сделайте один надрез, чтобы разрез меньше кровоточил и быстрее заживал.
- Обнажите череп. Подготовьте чистую и сухую область, чтобы максимизировать связь между передатчиком и костями черепа. Используйте аневризматические зажимы, чтобы захватить кожу головы.
- Аккуратно оттяните кожу головы от средней линии по четырем углам. Ищите анатомические ориентиры, такие как брегма и лямбда в черепе. Помните, что кости черепа не срастаются у животных в этом возрасте. Используйте атлас стереотаксических координат Paxinos, чтобы найти правильное местоположение отверстия для заусенцев.
- Используйте инструмент типа Дремель со сверлом типа заусенца. Создайте два отверстия для заусенцев в желаемых положениях записи диаметром более 300 мкм. Поместите отверстие для электрода сравнения над мозжечком за лямбдой черепа.
- Убедитесь, что провода на передатчике совпадают с отверстиями для заусенцев. Если электродные провода не выровнены, вероятно загрязнение электродов клеем, что приведет к ухудшению сигнала. Чтобы выровнять провода, проверьте посадку передатчика и аккуратно согните электроды, чтобы выровнять их по намеченным местам для отверстий для заусенцев.
- Подрежьте электродные провода. С помощью хирургических ножниц обрезайте электроды до нужной длины. Глубина электродов важна для типа записи, необходимой для эксперимента (т.е. размещайте электроды над твердой мозговой оболочкой для записи ЭЭГ или используйте стереотаксические координаты для определенных структур мозга).
- Обильно нанесите цианоакрилат на основание преобразователя, чтобы покрыть область, стараясь не покрывать электроды. Цианоакрилатный клей является электрическим изолятором, загрязнение электродов клеем не приведет к отсутствию сигнала.
- При записи из глубоких структур мозга установите передатчик на держатель канюли и поместите его в стереотаксический манипулятор для управления осью Z. Опустите передатчик с помощью стереотаксического рычага на соответствующую глубину и поместите цианоакрилатный гель вокруг передатчика.
- Тщательно высушите череп перед установкой передатчика, чтобы обеспечить прочное адгезионное соединение. Нанесите на череп передатчик, покрытый цианоакрилатом. Позаботьтесь о том, чтобы выровнять электроды с соответствующими отверстиями для заусенцев.
- Старайтесь избегать повреждения крупных сосудистых структур. Удерживайте передатчик на месте с небольшим давлением в течение одной минуты. Используйте легкое давление, чтобы сформировать прочную связь между передатчиком и черепом.
- Нанесите дополнительный цианоакрилат, достаточный для полной герметизации интерфейса передатчик/череп. Чтобы обеспечить хорошую посадку и прочное соединение, максимально увеличьте площадь поверхности клея, который контактирует с черепом. Нанесите цианоакрилатный клей по кругу вокруг передатчика, убедившись, что череп и стенка передатчика закрыты.
- Нанесите химический ускоритель (0,1 мл) через шприц вокруг цианоакрилата у основания имплантированного трансмиттера. Используйте ускоритель умеренно, стараясь не наносить его на соседние ткани.
заметка: Химическое ускорение отверждения цианоакрилата обеспечивает быстрое формирование прочной связи между передатчиком и черепом. Цианоакрилатный ускоритель полезен для ускорения отверждения клея, но не является необходимым.
- Удалите ускоритель, тщательно промыв область стерильным физиологическим раствором. Ускоритель цианоакрилатов может вызвать раздражение тканей, если его не смыть из области разреза. Чтобы промыть область, наполните шприц объемом 1,0 мл стерильным физиологическим раствором и орошите область через иглу шприца. Как правило, достаточно 0,5 мл физраствора, чтобы вымыть ускоритель.
- Зашите кожу вокруг основания передатчика, но не закрывайте его. Верхняя часть передатчика должна находиться над кожей для эффективной передачи нейронных сигналов. Обшивка должна быть достаточно плотной вокруг передатчика и клея вокруг устройства. Используйте викрил или шелковый шовный материал (мягкая нить); Кожа у неполовозрелых животных мягкая и легко повреждается, если не использовать мягкие швы. Для взрослых животных используйте любой шовный материал.
- Снимите животное со стереотаксической рамки и положите на подогреваемое одеяло для восстановления.
- Перед возвращением в плотину убедитесь, что животные находятся в тепле (37 °C) и находятся в амбулаторном состоянии (т. е. полностью выздоровели). Убедитесь, что животное увлажнено, ущипнув кожу на спине животного (если животное обезвожено, кожа останется деформированной). Если животное обезвожено, следует провести подкожное введение лактатного буфера Рингера. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
- Введение бупренорфина (0,05 мг/кг) животным для послеоперационного обезболивания и подкожное введение 0,1 мл бупивакаина вокруг места инъекции.
заметка: От начала до конца вся процедура должна быть завершена за 5-10 минут для животных этого возраста (6-й день после рождения). Для пожилых животных хирургическое вмешательство может занять больше времени.
3. Уход и жилье
Примечание: Некоторые матери могут не терпеть детенышей, которым имплантировано устройство. Возможно, потребуется выбрать плотины, которые будут устойчивыми. Для матери допустимо перемещать детенышей по садке, подхватывая их передатчиком.
- После того, как животные будут отлучены от груди, размещайте их отдельно, чтобы избежать снятия устройств с их партнера по клетке.
- Усыпляйте животных смертельной дозой пентобарбитала (25 мг/кг) или изофлурана (в колокольчике) при появлении признаков дистресса.
- Примечание: некоторые клетки для содержания животных с проволочными вставками могут мешать имплантированным передатчикам. Обязательно проверьте высоту проволочной вставки, чтобы убедиться, что животные не могут застрять передатчик между «стержнями» проволочной вставки.
4. Запись ЭЭГ
- Поместите животное в клетку отдельно или в совместное проживание с однопометниками и матерью. Однако в одну клетку следует помещать только одно имплантированное животное. Не оставляйте щенков одних в камере записи более чем на 2 часа. Следите за животными на предмет признаков стресса и обезвоживания.
- Подключите прилагаемый блок питания к базе приемника и убедитесь, что индикатор питания горит. Подключите базу ресивера к системе сбора данных с помощью кабелей Bayonet Neil-Concelman (BNC).
- Поместите клетку для животных на верхнюю часть основания приемника (Рисунок 1). «Сигнальный» индикатор должен загореться, указывая на то, что передатчик был обнаружен. Теперь данные могут быть записаны.
- Для записи данных необходимо подключить базу ресивера к аналого-цифровому преобразователю и подключить преобразователь к компьютеру (рисунок 2).
- Установите частоту дискретизации записи. Убедитесь, что выборка данных выполнена правильно. Выберите частоту дискретизации не менее 250 Гц (рекомендуется 500 Гц) для записи (полоса пропускания передатчика составляет 0,1-100 Гц).
- Сохраняйте оцифрованные данные и анализируйте их с помощью программных пакетов обработки сигналов, таких как Matlab.
