$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Настройка для резки срезов мозга
- Приготовьте раствор для резки, состоящий из (мМ) 125 холина-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl2, 6 MgCl2, 1,252PO4, 26 NaHCO3, 20 D-глюкозы, насыщенный карбогеном (95% O, 2–5% CO2) и раствор для записи искусственной спинномозговой жидкости (aCSF), состоящий из (мМ) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1,252PO4, 26 NaHCO3, 10 D-глюкоза, насыщенная карбогеном. Поместите режущий раствор на лед, чтобы он оставался холодным.
- Заморозьте примерно 400 мл режущего раствора и смешайте со 100 мл незамерзшего режущего раствора, чтобы получилась ледяная кашица. Пузырьки с карбогеном (95 % O, 2–5 % CO2) с расходом около 0,5 л/мин через трубки малого калибра или спеченное стекло для получения постоянного, но мягкого потока пузырьков.
- Подготовьте стакан объемом 250 мл с приподнятой вставкой из капроновой сетки, на который будут помещены срезы мозга. Заполните аксфом, чтобы покрыть сетку примерно на 2 см, и заболочьте карбогеном, следя за тем, чтобы пузырьки не нарушили напрямую область удержания ломтика. Также важно, чтобы в капроновой сетке не было пузырьков воздуха, поэтому если таковые присутствуют, удалите их. Это будет камера выдержки, которая хранится при температуре RT (20 - 25 °C).
- Разложите инструменты для препарирования, включая большие ножницы, маленькие ножницы, маленькие и большие микрошпатели, а также большие и маленькие щипцы, и охладите их на льду. Поместите блок для резки тканей вибратомом на лед на квадрат из алюминиевой фольги. Возьмите 2 куска фильтровальной бумаги по 6 см, лезвие бритвы с одним лезвием и стакан объемом 25 мл, наполненный суспензией для режущего раствора.
- Наполните вторую емкость льдом, а на лед положите лист папиросной бумаги и поставьте сверху чашку для культуры диаметром 12 см. Заполните чашку для культуры режущим раствором ледяной суспензии и пузырем с карбогеном. Это контейнер, в котором будет проводиться диссекция мозга.
- Подготовьте вибратом. Извлеките свежее лезвие обоюдоострой бритвы (каждый раз используйте новое лезвие) из упаковки и распылите 80% этанола, а затем деионизированной водой. Разрежьте пластиковую переводную пипетку объемом 3 мл в том месте, где она начинает сужаться. Это будет использоваться для переноса срезов мозга. Согните иглу 27 G у основания примерно на 45° и прикрепите к шприцу объемом 1 мл. Это будет использоваться для манипуляций с срезами во время резки.
2. Нарезка мозговых срезов
- Обезболите мышь (P16-P18) 2% изофлураном или местно одобренным методом. После индукции обезглавьте животное большими ножницами и опустите голову в 12-сантиметровую чашку для культивирования, содержащую кашицу из раствора для резки с пузырьками. Суспензия должна полностью погружать напор для быстрого охлаждения.
- Держите переднюю часть головы одной рукой, отшелушивая кожу и соединительную ткань вперед по направлению к носу. С помощью маленьких ножниц разрежьте соединительную ткань, чтобы обнажить подлежащий череп. Затем удалите мышцы, расположенные над спинной частью черепа и шеи.
- Удалите мозг из черепа, сначала закрепив переднюю часть черепа большими щипцами, а затем сделайте два боковых разреза через кость по обе стороны от большого затылочного отверстия с помощью маленьких ножниц (Рисунок 1, надрезы обозначены А1 и А2).
- Сделайте еще один разрез между глазами (прямо перед брегмой) (Рисунок 1, разрез с маркировкой В), затем аккуратно разрежьте вдоль сагиттального шва спереди и отразите разрезанные участки черепа, чтобы показать мозг (Рисунок 1, разрез с маркировкой С).
- С помощью небольшого шпателя вычерпните мозг и положите его на тарелку для посева. Помните о черепных нервах в нижней части мозга, которые необходимо будет разорвать, это можно сделать с помощью микрошпателя меньшего размера. С помощью большего шпателя перенесите мозг в стакан объемом 25 мл, наполненный раствором для резки кашицы.
- Подготовка полушария мозга к нарезке.
- Положите один кусок фильтровальной бумаги толщиной 6 см на дно формы для свежей культуры, затем заполните свежим раствором для резки, кашицей и пузырем. С помощью большего шпателя поместите мозг вентральной стороной вниз на фильтровальную бумагу. Возьмите новое и очищенное лезвие бритвы с одним лезвием и разрежьте мозг, чтобы удалить мозжечок, затем сделайте надрез по средней линии, чтобы разделить мозг на два полушария.
- Готовим вибратомный блок ткани.
- Возьмите охлажденный блок ткани вибратома, высушите поверхность и поместите каплю цианоакрилатного клея в середину и равномерно распределите до приблизительного размера мозга. Используйте маленький шпатель, чтобы манипулировать одним из полушарий мозга на большом микрошпателе так, чтобы медиальная сторона мозга была опущена.
- Коснитесь края шпателя на границе мозга вторым листом фильтровальной бумаги, чтобы удалить как можно больше раствора. Сдвиньте мозг с большего шпателя с помощью меньшего шпателя, чтобы направить его на клей.
- Закрепите режущий блок в вибратомной камере и заполните камеру суспензией и пузырьками режущего раствора, обеспечивая полное погружение мозга. Поверните режущий блок так, чтобы вентральная сторона мозга была обращена к лезвию.
- Срезание мозга.
заметка: Каждый вибратом уникален, поэтому следуйте инструкциям производителя.
- Установите толщину среза на 450 мкм и убедитесь, что лезвие вибрирует, когда оно движется по мозгу со скоростью примерно 0,3 мм/с. Полностью разрежьте мозг от вентральной стороны до поверхности коры, чтобы получить целые сагиттальные срезы мозга, которые можно использовать для электрофизиологических записей. Срезы будут производиться латерально или медиально, и обычно из каждого полушария можно нарезать 3-4 ломтика.
- Если основание ломтика приподнимается, с помощью согнутой иглы 27 G аккуратно прижмите ломтик обратно. Когда каждый ломтик будет разрезан, с помощью переводной пипетки переместите его на платформу в камере выдержки, где они будут жизнеспособны до 8 часов.
3. Записи внеклеточной электрофизиологии
- Установка среза в камеру записи.
- С помощью переводной пипетки поместите срез мозга в погружную записывающую камеру, перфузированную с проточной кислотой 1–2 мл/мин и нагретую до 32 °C. КСФ, используемый для регистрации, отличается от такового в камере выдержки, так как концентрация Mg2+ увеличивается с 2 мМ до 4 мМ.
- Закрепите срез «арфой» (полукруглая нержавеющая сталь с нейлоновыми нитями, натянутыми поперек на расстоянии 2 - 3 мм). Расположите арфу так, чтобы пряди шли параллельно CA1. Увеличьте скорость перфузии до 8 - 10 мл/мин при 32 °C.
- Под рассекающим микроскопом поместите стимулирующий электрод и записывающий электрод (стеклянный электрод, заполненный записывающим раствором aCSF) на поверхность лучистого слоя CA1 (рис. 2А). Сначала поместите стимулирующий электрод, затем поместите записывающий электрод.
- Стимулируйте коллатерали Шаффера с помощью тестового импульса амплитудой 120–150 мкА и длительностью 0,1 мс и наблюдайте за полученной формой сигнала возбуждающего постсинаптического потенциала (fEPSP) для определения состояния среза (рис. 2B). Стимулирующие и записывающие электроды могут быть перемещены в срез примерно на 50 - 100 мкм от поверхности среза для получения записи fEPSP с небольшим залпом волокон и большой амплитудой. Вызванные fEPSP по коллатеральному методу Шаффера стереотипны и являются хорошим индикатором здоровья срезов. Здоровые ломтики обычно показывают отношение количества волокон к амплитуде fEPSP менее 0,3.
- Изменение положения электродов.
- С помощью препарирующего микроскопа переместите стимулирующий электрод к середине слоя oriens и переместите записывающий электрод к пирамидальному слою ячейки как можно ближе к записывающему электроду, как показано на рисунке 3А. Возможно, потребуется втолкнуть стимулирующие и записывающие электроды в срез с углом приблизительно 50–100 мкм, чтобы амплитуда отклика fEPSP на испытательный импульс 120–150 мкА составляла примерно 1 мВ.
- Генерация γ колебаний.
- Чтобы вызвать γ колебаний, стимулируйте ткань последовательностью из 20 импульсов по 0,1 мс, подаваемых с частотой 200 Гц. Этот тетанический стимул может давать воспроизводимые реакции при подаче каждые 5 минут.
- Используйте следующие параметры записи.
- Масштабируйте коэффициент усиления выходного сигнала в соответствии с диапазоном входного напряжения аналого-цифрового преобразователя. Убедитесь, что для максимального ожидаемого отклонения сигнала используется минимум 30% от диапазона входного напряжения. Будьте осторожны при установке слишком большого коэффициента усиления, так как сигнал может обрезаться. Типичная полоса пропускания, необходимая для полевых записей, составляет 500 Гц с переменным током на частоте 0,1 Гц для устранения дрейфа базовой линии.
- Оцифровывайте сигнал не менее чем в 4–5 раз быстрее, чем угловая частота фильтра нижних частот, чтобы избежать искажения сигнала.
