Прямая электроретинограмма пигментного эпителия сетчатки у мыши

Аннотация

Источник: Miyagishima, K. J., et al. Прямосвязанная электроретинограмма (DC-ERG) для регистрации вызванных светом электрических реакций пигментного эпителия сетчатки мыши на рисунке. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует запись электроретинограммы с прямой связью (DC-ERG) на адаптированном к темноте, анестезируемом пигментном эпителии сетчатки мыши (RPE). После нанесения расширяющих капель животное помещают в записывающую установку, а на роговицу помещают капиллярный электрод, заполненный солевым буфером. После установления исходного уровня регистрируется DC-ERG.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Позиционирование мыши и электродов

1. Держите мышей на ночь в хорошо проветриваемой, светонепроницаемой коробке для адаптации к темноте.
2. Животным проводили обезболивание путем внутрибрюшинного введения кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (8 мг/кг).
3. Нанесите каплю 0,5% пропаракаина HCl местно для обезболивания роговицы, а также каплю 2,5% фенилэфрина HCl и 0,5% тропикамида для расширения зрачков.
4. Обрежьте усы мыши ножницами, чтобы случайные подергивания не помешали стеклянным капиллярным электродам во время записи.
   заметка: Протокол стимуляции электроретинограммы с прямой связью (DC-ERG) в системе ERG имеет несколько встроенных стимульных процедур, которые можно выбрать, нажав на кнопку «Шаг» (стрелка вперед) или «Шаг» (стрелка назад). Для подготовки и выполнения записи DC-ERG требуются только шаги 1, 4 и 5 в программном обеспечении.
5. В системе ERG программное обеспечение проверяет, был ли выбран правильный пациент. Нажмите на зеленую кнопку «Протоколы». В разделе Описание протокола выберите DC-ERG. Затем нажмите на кнопку «Выполнить». Убедитесь, что выполняется правильный тест, нажав «Да».
6. Используйте стимул с шагом 1/6, обозначенный как «Красный свет», чтобы включить красный свет внутри купола, чтобы помочь расположить мышь и электроды при наблюдении за изменениями импеданса.
7. Поместите мышь на подогреваемый стол для записи и тщательно наденьте тент на кожу задней ноги с помощью щипцов. Крепко держите игольчатый электрод в одной руке и вставьте его подкожно в заднюю ногу, чтобы зафиксировать его на месте.
8. Поместите электрод сравнения Silver/Siverchloride (Ag/AgCl) внутрь рта так, чтобы спеченная гранула располагалась вдоль задней щеки и удерживалась на месте за зубами.
   заметка: Электроды из золотой проволоки не следует использовать в качестве рового электрода сравнения, так как они имеют разные импедансные характеристики и увеличивают размах шума.
9. Перед тем как поднести капиллярные электроды к глазу мыши, держите держатель электродов со стеклянными капиллярами вертикально и проведите по держателю электродов указательным пальцем, чтобы удалить любые пузырьки, которые могли быть занесены. Наполните наконечник сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS) с помощью иглы массой 25 г, прикрепленной к шприцу, и осмотрите на кончике, чтобы убедиться, что на кончике нет пузырьков воздуха. Расположите держатель электродов так, чтобы открытый кончик капилляров, заполненных HBSS, находился в мягком контакте с роговицей.
10. Соблюдайте специальные меры предосторожности, чтобы избежать появления пузырьков воздуха, держа дозатор геля для глаз перевернутым и сбрасывая первоначальные капли. Нанесите каплю лубрикантного геля для глаз на каждый глаз, чтобы сохранить проводимость и предотвратить высыхание во время записи.

2. Запись DC-ERG

1. Нажмите на Шаг (стрелка вперед), чтобы выбрать Шаг 4/6 «Длинная вспышка Но-Ли».
2. Нажмите на Импеданс. Используйте экран «Проверка импеданса» для изучения сопротивления левого и правого глаза. Ожидается, что значения импеданса для записывающих электродов на каждом глазу будут одинаковыми (~39 кОм). Ожидается, что значения импеданса для заземляющего электрода и электродов сравнения будут менее 10 кОм.
3. Нажмите на кнопку «Предварительный просмотр», чтобы просмотреть следы для левого и правого глаза. Подождите, пока не будет достигнут стабильный базовый уровень (<10 мин). Нажмите кнопку "Стоп", чтобы выйти из предварительного просмотра трассировки.
   заметка: Резкие изменения направления дрейфа или аберрантный шум в записи со временем не улучшатся и потребуют идентификации капиллярного электрода, требующего внимания. Наиболее вероятной причиной является пузырь, занесенный на кончик электрода. Наполните наконечник HBSS. Нажмите кнопку «Предварительный просмотр» еще раз, чтобы проверить базовую линию.
4. Нажмите на Шаг (стрелка вперед), чтобы выбрать Шаг 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min." Нажмите Run, чтобы начать запись.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ag/AgCl (ротовой) электрод	ВПИ Инк	ЭП1	Ротовой электрод сравнения для мыши
керамическая плитка	Инструмент Саттера	КТС	Используется для разрезания стеклянной капиллярной трубки до соответствующего размера
Палочка для чистки с хлопковым наконечником	Пуританские медицинские изделия	867-WC Без клея	Для использования в качестве прокладки для улучшения прилегания электрододержателя в сборе
Система электроретинограммы (ЭРГ)	ООО «Диагнозис»	Система E3	Система визуальной электрофизиологии для диагностики офтальмологических состояний в исследованиях зрения и испытаниях лекарств
Горелка Бунзена	Аргос Технолоджис	BW20002460	Или равноценный для придания формы стеклу под пламенем
Стеклянная капиллярная трубка (1,5 мм)	Инструменты Саттера	БФ150-75	Для наполнения HBSS и контакта с роговицей
Буферизованный раствор соли Хэнка (HBSS)	Thermo Fisher Scientific Inc	14175-095	Имеющихся. Обслуживание на RT
Встроенный фильтр	ватман	6722-5001	Для защиты вакуумного насоса от аэрозолей
Малошумящий кабель для держателей микроэлектродов	ВПИ Инк	5372	Предлагается для улучшения длины и размещения кабелей и электрододержателей в сборе
Магнитный шаровой шарнир	ВПИ Инк	500871	Для магнитного позиционирования электрододержателя в сборе на сцене
МатЛаб	Математические работы		MatLab: Для редактирования аналитического программного обеспечения
Набор инструментов Matlab Curvefit	Математические работы		Toolbox for MatLab (требуется только для редактирования аналитического программного обеспечения)
Компилятор MatLab	Математические работы		Инструментарий для MatLab (требуется только для редактирования и повторного выпуска аналитического программного обеспечения)
MatLab Runtime версия 9.5	Математические работы	R2018b (9,5)	Для запуска аналитического программного обеспечения: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Держатели микроэлектродов (45 градусов)	ВПИ Инк	МЭН345-15	Для удержания капилляров
Игла (25 ga)	Ковидьен	8881250313	Для наполнения капиллярных трубок HBSS
игольчатый (заземляющий) электрод	Ритмлинк	13 мм - один элктрод	Подкожный игольчатый электрод (заземление) для мыши (длина 13 мм, диаметр игла 0,4 мм, подводящий провод 1,5 м)
Регулятор/стабилизатор мощности	Фурман	-1800	Или эквивалент устранения смещения по постоянному току от шума, поступающего через линию электропередачи
Шприц (12 мл)	Моноджект	1181200777	Для наполнения капиллярных трубок HBSS
Т-образный зажим	Коул-Пармер	06852-20	Для сборки электрододержателей
Вакуумный эксикатор	Бел-Арт	420120000	Прозрачное дно и крышка из поликарбоната
Фармакологическое лечение
Гель-смазка для глаз	Алкон	0078-0429-47 (Английский	Помогает смазывать поверхность роговицы и поддерживать электрический контакт с капиллярными электродами
Фенилэфрина гидрохлорид 2,5%	Акорн	17478-201-15	Мидриатические глазные капли короткого действия (для расширения зрачков)
Пропаракаина гидрохлорид 0,5%	Акорн	17478-263-12	Местный анестетик для офтальмологической инстилляции
Тропикамид 0,5%	Акорн	17478-101-12	Мидриатические глазные капли короткого действия (для расширения зрачков)
Ксилазин	АнаСед	sc-362949Rx	Обезболивающее и миорелаксантное средство
Зетамин (гидрохлорид кетамина)	ВетОдин	501072	Анестетик для внутримышечных инъекций

. )