Электрофизиологические записи у Drosophila sensilla в ответ на летучие запахи

Аннотация

Источник: Ng, R., et al. Электрофизиологическая регистрация от Drosophila Trichoid sensilla в ответ на запахи низкой летучести. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео живая муха дрозофилы установлена в трубку для электрофизиологических исследований. Электроды расположены у основания сенсиллума для записи специфических реакций нейронов на феромоны с нейронами обонятельных рецепторов мухи.

Протокол

1. Подготовка оборудования к записи at4

1. С помощью инструмента для вытягивания пипеток подготовьте электроды с капиллярами из алюмосиликатного стекла (наружный диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,64 мм). Слегка притупите кончик электрода сравнения парой тонких щипцов, чтобы облегчить введение в клипеус мухи (т.е. закругленную пластину в передней части головы мухи, над ротовым аппаратом).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались 7-дневные самцы WT (дикого типа) (Берлин). Используйте солевой раствор AHL в качестве электролита для обоих электродов.
2. Приготовьте 1 л AHL (Adult Hemolymph-like), смешав 900 мл дистиллированной воды с 6,312 г NaCl, 0,373 г KCl, 0,337 г NaHCO₃, 0,1120 г₂PO₄, 1,892 г трегалозы ּ2H₂O, 3,423 г сахарозы, 1,192 г HEPES(N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этанесульфоновая кислота), и 8,2 мл 1М MgCl₂. Используя дистиллированную воду, доведите общий объем до 1 л. Доведите pH до 7,4 с помощью 1 N NaOH и простерилизуйте раствор с помощью вакуумной фильтрующей системы. Для длительного хранения необходимо хранить аликвоты AHL при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильная подача пальмитолеиновой кислоты зависит от однородности картриджей. Каждый картридж должен быть собран воспроизводимым образом.
3. С помощью бритвенного лезвия удалите 0,9 см от кончика пипетки объемом 200 мкл, чтобы получилась первая секция картриджа размером 4,1 см; обратитесь к размерам, приведенным на рисунке 1A. Используйте еще один кончик пипетки объемом 200 мкл и удалите 1,7 см и 1,5 см от наконечника и основания, чтобы создать вторую секцию картриджа. размером 1,8 см (рисунок 1А). Используйте линейку для обеспечения воспроизводимости.
4. Используйте дырокол 1/8 дюйма, чтобы вырезать диски из фильтровальной бумаги.
5. С помощью щипцов поместите диск из фильтровальной бумаги на кончик второй секции картриджа. Визуально подтвердите наличие отверстия в наконечнике картриджа, через которое может проходить воздух.
6. Прикрепите первую и вторую секции картриджа, как показано на рисунке 1A. Наклоните вторую секцию картриджа вниз, чтобы облегчить прямое прицеливание в препаре (рисунок 1B).
7. Подсоедините картридж к трубке подачи запаха, установленной на микроманипуляторе.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Такая конструкция позволяет поворачивать картридж наружу для облегчения замены (Рисунок 1C).
8. Установите постоянный расход увлажненного воздуха на уровне 2 л/мин в одном регуляторе массы, а расход одоранта на 500 мл/мин в другом регуляторе массы.
9. С помощью программного обеспечения (см. Таблицу материалов) запрограммируйте процедуру введения затяжки с запахом 500 мс.

2. Приготовление растворов одорантов пальмитолеиновой кислоты для доставки

ПРИМЕЧАНИЕ: Or47b ORNs реагируют как на цис-, так и на транс-пальмитолеиновую кислоту. Поскольку пальмитолеиновая кислота нестабильна при ртутной терапии, запасы хранят при температуре -20 °C и используют в течение месяца после вскрытия. Этанол является предпочтительным растворителем для пальмитолеиновой кислоты.

1. Используйте вихревой смеситель для тщательного смешивания 10 мкл запасов цис- или транспальмитолеиновой кислоты или разведений с 90 мкл 100% этанола для десятикратного серийного разведения в микропробирках объемом 1,7 мл. Готовьте свежие разбавления пальмитолеиновой кислоты ежедневно перед экспериментами и используйте в течение дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянный флакон рекомендуется использовать для одорантов, не растворимых в этаноле, для приготовления разбавлений запаха другими типами органических растворителей.
2. С помощью микропипетки P10 нанесите 5 мкл растворов цис-пальмитолеиновой кислоты желаемых разведений на фильтровальную бумагу в каждом соответствующем картридже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Самая высокая дозировка (^10-1) содержит 450 мкг соединения. Для растворов транс-пальмитолеиновой кислоты вносите 4,5 мкл так, чтобы максимальная дозировка (^10-1) содержала 450 мкг соединения.
3. Поместите картриджи с пальмитолеиновой кислотой в вакуумный эксикатор на 1 ч при температуре RT и давлении 7,59 мм рт.ст. для полного испарения растворителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Картриджи можно использовать до 4 часов в режиме RT.

3. Подготовка дрозофилы к свободному доступу к at4 Sensilla для электрофизиологических записей in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи WT (Берлин) выращиваются в стандартной среде из кукурузной муки при температуре 25°C в цикле свет-темнота 12:12. После выведения мухи разделяются по полу на группы по десять особей, причем они размещаются в группах до 7-дневного возраста. Or47b ORNs (нейроны обонятельных рецепторов) как у самцов, так и у самок мух реагируют на пальмитолеиновую кислоту. Для простоты в текущем исследовании исследуются только самцы мух.

1. Соберите слайд для подготовки к полету: на стеклянном предметном стекле поместите стеклянный покровный лист (18 x 18 мм2) на небольшое количество пластилина, образуя угол ~3° со стеклянным предметным стеколом. Наклейте двусторонний скотч на внутренний край покровного стекла и область предметного стекла непосредственно под ним. Заменяйте на свежую ленту на каждый день записи (рисунок 2А).
2. С помощью аспиратора от мух15 соберите интересующую муху в трубке, а затем наденьте наконечник пипетки объемом 200 мкл на конец трубки. Одновременно поверните трубку вперед, вдувая в нее воздух, чтобы подтолкнуть муху к концу наконечника пипетки. Используйте лезвие бритвы, чтобы срезать чуть ниже тела мухи и на 2 головы выше мухи.
3. Утрамбуйте дно кончика пипетки пластилином, проталкивая муху вверх до тех пор, пока не обнажаются усики и клипеус (рис. 2B). Чтобы не убить муху, добавляйте только столько глины, чтобы обнажить усики и аристы, так как это предотвращает раздавливание брюшка мухи. Кроме того, медленно и осторожно добавляйте глину, чтобы предотвратить резкое сужение. Убедитесь, что муха жива, проверив движение усиков или хоботка.
4. С помощью щипцов маневрируйте наконечником пипетки, на котором находится муха. Ориентируйте голову так, чтобы клипеус был обращен вправо от наблюдателя. Отрегулируйте подготовку вдоль покровного стекла с помощью тонких щипцов до тех пор, пока боковая сторона антенны не прилегнет к поверхности покровного стекла (Рисунок 2B).
5. Поместите на arista удерживающий стержень, чтобы прикрепить антенну к двустороннему скотчу во избежание смещения (Рисунок 2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удерживающий стержень извлекается из капилляра из боросиликатного стекла с помощью съемника для пипетки и удерживается в положении с помощью пластилина (рис. 2A).
6. Поместите преп на сцену установки (рис. 2C). С помощью микроскопа подтвердите, что трихоид виден вдоль дистально-бокового края третьего сегмента антенны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Силуэты сенсилл должны быть силуэтами на фоне, что упрощает их идентификацию и облегчает съемку (рис. 3). В этом препарате наиболее доступны трихоидные сенсиллы типа at4.
7. Как описано ранее, 2, 15, держите препарат под постоянным потоком увлажненного воздуха (2 л/мин), подаваемым через отдельную трубку подачи воздуха примерно в 2 см от препарата (рисунок 4).

4. Регистрация активности at4 Sensillum от Or47b ORNs в трихоидах at4 в ответ на пальмитолеиновую кислоту

1. Вставьте электрод сравнения в клипеус (Рисунок 3A). Быстрыми и плавными движениями убедитесь, что электрод введен чуть ниже поверхности, где он может контактировать с гемолимфой под кутикулой, чтобы избежать повреждения тканей.
2. Медленно опустите записывающий электрод до тех пор, пока он не войдет в ту же плоскость обзора, что и целевой сенсиллум (рис. 3B). Запись под объективом с 50-кратным увеличением.
   заметка: Жесткая трихоидальная кутикула требует введения записывающего электрода в сенсиллярное основание, более широкая площадь которого обеспечивает более крупную мишень, что снижает вероятность отклонения электрода (рис. 3B, вставка).
3. Прежде чем применять к сенсиллуму раздражители запаха, соблюдайте следующие критерии выбора: любой трихоид, не соответствующий этим нормам, должен быть отвергнут, а вместо него следует выбрать другой сенсиллум.
   1. Наблюдайте высокое отношение сигнал/шум (см. пример на рисунке 3C).
   2. Наблюдайте за идентифицируемыми спайками от нейронов at4A и at4C (рис. 3C).
      Амплитуда спайка at4B очень похожа на at4A10 и не может быть легко идентифицирована без стимуляции запахом.
   3. Обратите внимание, что базальная частота возбуждения нейронов at4A составляет около или ниже 20 Гц.
      Примечание: Этот критерий специфичен для at4A, потому что базальная скорость возбуждения для нейрона выше, чем у базиконных ORNs. Гораздо более высокое базальное возбуждение указывает на то, что нейроны могли быть повреждены во время введения электродов.
4. Подсоедините картридж к трубке подачи одоранта. Начните с контроля растворителей, а затем с одорантов, от низких до высоких концентраций. Используйте микроманипулятор для маневрирования картриджа в направлении препа, направляя картридж прямо в головку препа. Визуально подтвердите, что картридж направлен прямо на антенну (рисунок 4) с расстояния в несколько миллиметров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы ориентировать отверстие картриджа непосредственно на антенну и расположить его рядом с целевой тканью.
5. Убедитесь, что картридж с одорантом отделен от регистрирующего электрода справа от него на 1 - 2 мм и от предметного стекла для подготовки мушки внизу примерно на 1 мм.<бр/> заметка: В описанной здесь конфигурации картридж с одорантом тесно ограничен записывающим электродом, электродом сравнения и предметным стеклом для подготовки к мухе (рис. 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывайте расстояние между картриджем и записывающими/референсными электродами. Рекомендуется расстояние около 4 мм. Непреднамеренный контакт может прервать сигнал и сломать кончик записывающего электрода, повредить текущий нейрон и затруднить дальнейшую запись.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывайте расстояние, разделяющее картридж и затвор для подготовки к полету. Прикосновение к покровному стеклу также может привести к смещению записывающего электрода, что нарушит запись.
6. Нажмите кнопку "Запись" в программном обеспечении для сбора данных, чтобы начать запись.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой записи продолжительностью 10 секунд один импульс запаха длительностью 500 мс подается непосредственно на антенну, как описано в шаге 1.9.
7. После нанесения одоранта осторожно втяните картридж, прежде чем заменить его картриджем следующей по величине концентрацией. Продолжайте до тех пор, пока не будет получен весь диапазон дозировок.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется регистрировать только один Or47b ORN от каждой мухи, чтобы избежать любых возможных эффектов адаптации.
8. Тщательно промойте записывающий электрод дистиллированной водой после окончания записи за день.
9. Анализируйте и отображайте данные с помощью коммерчески доступного программного обеспечения для автономного анализа.

Результаты

Рисунок 1: Настройка картриджа и ольфактометра. (А) Приготовление картриджей с запахом. Слева направо: стандартный наконечник для дозатора объемом 200 мкл, первая и вторая секции картриджа, а также готовый картридж с одорантом. (B) Картридж, подключенный к ольфактометру, показывающий наклон второй секции вниз. (C) Установка ольфактометра, изображающая трубку подачи запаха, установленную на микроманипуляторе, с прикре...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Подготовка и разные материалы
Инструмент для вытягивания пипеток	Sutter Instruments, Новато, Калифорния, США	П97	Съемник пипеток
Капилляры боросиликатного стекла	World Precision Instruments, Сарасота, штат Флорида, США	1В100Ф-4	для изготовления удерживающих стержней
Капилляры из алюмосиликатного стекла	Sutter Instruments, Новато, Калифорния, США	АФ100-64-10	для изготовления электродов
Предметные стекла для микроскопа Superfrost	Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	Тел.: 12-550-143	для станции fly-prep
Постоянный двусторонний скотч	Скотч Сент-Пол, штат Миннесота, США	NA	для станции fly-prep
Вертикальный микроскоп	Олимп, Синдзюку, Токио, Япония	БХ51	для записывающей установки
Пластилина для лепки	Ван Акен, Северный Чарльстон США	B0019QZMQQ	для подготовительной станции и для стабилизации удерживающего стержня
Быстроточный стерильный одноразовый фильтрующий блок с мембраной SFCA, 0,45 мм	Nalgene, Рочестер, штат Нью-Йорк, США	#156-4045	стерилизовать раствор АГЛ
Наконечник для дозатора 200 мкл	VWR Раднор, Пенсильвания США	53508-810 (Английский)	для изготовления картриджей с запахом и подготовки к мухам
фильтровальная бумага	Ватман, Мейдстон, Кент, Великобритания	740-Е	для изготовления картриджей с запахом
Вакуумный эксикатор	Коул-Пармер, Вернон Хиллз, Иллинойс, США	ВХ-06514-30	для испарения растворителя этанола
цис-пальмитолеиновая кислота	Cayman Chemical, Анн-Арбор, Мичиган, США	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Одорант Or47b
транспальмитолеиновая кислота	Cayman Chemical, Анн-Арбор, Мичиган, США	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Одорант Or47b
этанол	Spectrum Chemical MFG. Нью-Брансуик, штат Нью-Джерси, США	Е1028-500МЛГЛ	для разбавления пальмитолеиновой кислоты
Микроманипулятор картриджа с одорантом	Сискию, Грантс Пасс ИЛИ США	МХ130Р	для позиционирования ольфактометра
Программное обеспечение Flow Vision	Alicat, Тусон, Аризона, США	FLOWVISIONSC	программное обеспечение для контроля расхода
Массовый контроллер	Alicat, Тусон, Аризона, США	МС-2SLPM-D	для управления расходом увлажненного воздуха
Массовый контроллер	Alicat, Тусон, Аризона, США	MC-500SCCM-D	для управления расходом для стимуляции запаха
Зажим	Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США	Версия 10.4	Программное обеспечение для сбора данных
Трубка подачи воздуха	Ace Glass, Вайнленд, штат Нью-Джерси, США	8802-936	для подачи увлажненного воздуха
50-кратный объектив	Олимп, Синдзюку, Токио, Япония	LMPLFL50X	Записывающая установка
Зажим 10	Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США	Версия 10.4	Программное обеспечение для анализа спайков
Игорь Про 6	WaveMetrics, озеро Освего или США	Версия 6.37	Программное обеспечение для анализа данных
Аудиомонитор	ALA Scientific Instruments, Фармингдейл, штат Нью-Йорк, США	NPIEXB-AUDIS-08B	Ауарально сообщает об отдельных всплесках
Внеклеточный усилитель	ALA Scientific Instruments, Фармингдейл, штат Нью-Йорк, США	NPIEXT-02F	для увеличения амплитуды электрических сигналов
Контроллер клапана	Уорнер Инструментс	ВК-8	для управления открытием клапана для стимуляции запаха
Микроманипулятор записывающих электродов	Sutter Instruments, Новато, Калифорния, США	МП-285	для позиционирования записывающего электрода
Усилитель для верхней сцены	ALA Scientific Instruments, Фармингдейл, штат Нью-Йорк, США	ЭКВ-16.0008	для увеличения амплитуды электрических сигналов
осциллоскоп	Tektronix, Бивертон или США	TDS2000C	Визуальный отчет по отдельным шипам