Стимуляция корешков слуховых нервов и запись постсинаптических токов в срезе клина мозга мыши

Abstract

Источник: Fischl, M. J., et al. In Vitro Wedge Slice preparation for imimicing in vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp.(2020)

Это видео демонстрирует протокол стимуляции корешка слухового нерва и записи постсинаптических токов в медиальных оливокохлеарных нейронах в срезах клина мозга мыши.

Protocol

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Настройка и запись электрофизиологии

1. Поместите ломтик клина в камеру звукозаписи и закрепите ломтик с помощью арфы или стабилизирующей системы. Непрерывно перфузируйте ткань со скоростью 7-10 мл/мин теплым (35 °С) ACSF, пузырчатым с карбогеном.
2. Идентификация генетически меченых медиальных оливокохлеарных нейронов MOC в вентральном ядре трапециевидного тела VNTB с использованием эпифлуоресценции с эмиссионными фильтрами 561 нм для записи патч-клэмпа. Переверните срез, если нет потенциально поддающихся исправлению ячеек.
3. Используя оптику DIC, сосредоточьтесь на корешке слухового нерва на толстой стороне среза и с помощью микроманипулятора переместите биполярный вольфрамстимулирующий электрод вниз к корешку слухового нерва и мягко на поверхность ткани><. заметка: Всасывающие электроды использовались в экспериментах по стимуляции слуховых нервов в других лабораториях. Электроды из тетастеклянного стекла или методы оптической стимуляции могут быть использованы, если это применимо к другим специфическим препаратам.
4. Переместите поле зрения обратно в VNTB, чтобы выбрать нейрон MOC, на который будет нацелен электрофизиология пластыря.
5. Наполните записывающую пипетку подходящим внутренним раствором для предполагаемого эксперимента.
6. Патч и запись с нейрона MOC в конфигурации всей клетки. При необходимости компенсируйте емкость мембраны и последовательное сопротивление.
7. Отрегулируйте амплитуду электростимуляции корешка слухового нерва для получения последовательных постсинаптических событий в нейроне MOC.
   заметка: Может потребоваться перемещение электрода стимуляции.
8. Запустите соответствующие протоколы стимуляции для наблюдения за вызванными синаптическими токами в MOC (зажиме напряжения).
   заметка: Препарирование клиновидного среза можно использовать с любыми типичными инструментами наложения пластыря, такими как запись свободных пластырей, фармакология, оптогенетика, визуализация кальция, высвобождение нейротрансмиттеров и т. д.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A1R Вертикальный конфокальный микроскоп	Приборы Nikon		Электрофизиология и визуализирующий микроскоп, может быть любой микроскоп, совместимый с электрофизиологией
Электрод боросиликатный стекло с нитью наружного диаметра 1,5 мм, внутренний диаметр 1,1 мм, длина 10 см	Инструмент Саттера	БФ150-110-10	Патч-зажим для стекла для пипетки
Электродный наполнитель MicroFil	ВПИ	СМФ20Г	Патч-электрод для дозатора
Встраиваемый консоционный нагреватель	Warner Instruments (GSAdvantage)	СХ-27Б	Нагреватель системы перфузии для срезов
Мультимикроманипуляторные системы	Саттер Интрументс	MPC-200 с MP285	Микроманипуляторы для установки патч-зажимов и электродов для стимуляции
P-1000 Горизонтальный съемник для стеклянных микропипеток	Инструменты Саттера	ФГ-П1000	Съемник дозатора с патч-зажимом
Усилитель с патч-клэмпингом и программное обеспечение	ХЕКА	EPC-10 / Патчмастер Следующий	Может быть любой усилитель/программное обеспечение
Записывающая камера	Уорнер Инструментс	РК26Г	Срез "ванны" во время записи
Камерная звукозаписывающая арфа	Уорнер Инструментс	640253	Стабилизирует срез при электрофизиологической регистрации
Инкубационная камера для срезов	Пользовательская сборка		Подогреваемая, насыщенная кислородом камера выдержки для ломтиков во время восстановления после нарезки
Блок изоляции стимулов	A.M.P.I.	Изо-Флекс	Блок изоляции стимулов для электрофизиологии
Шприц 60CC	Fischer Scientific (Интрамоллы)	Телефонный номер 14-820-11	Электрофизиология перфузионной жидкости для работы с жидкостями
Регулятор температуры	Warner Instruments (GSAdvantage)	ТК-324К	Регулятор температуры системы перфузии
Трубка 1/8 наружного диаметра 1/16 внутреннего диаметра	Fischer Scientific (Интрамоллы)	14-171-129	Электрофизиология перфузионной жидкости для работы с жидкостями
Тугстрамовый концентрический биполярный микроэлектрод	ВПИ	TM33CCINS	Электрод стимулирующий для электрофизиологии