$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Запись синаптических ответов CA3-CA1
ПРИМЕЧАНИЕ: Электрофизиологическая установка, используемая для регистрации потенциала поля, показана на рисунке 1A. Клетка Фарадея настоятельно рекомендуется, если электрические помехи выходят из-под контроля после надлежащего заземления электрических настроек. В продаже имеется множество различных типов погружных и интерфейсных камер. Тем не менее, интерфейсные камеры предпочтительны, поскольку срезы демонстрируют в них более устойчивые синаптические реакции.
- Позиционирование электродов
- Включите электроприборы (стимуляторы и усилители), которые будут использоваться. Установите и закрепите стимулирующие и записывающие электроды в держателях из оргстекла микроманипуляторов.
заметка: Мы используем монополярные, покрытые лаком, электроды из нержавеющей стали сопротивления 5 МОм как в стимулирующих, так и в регистрирующих целях.
- Перед использованием вставьте эти электроды внутрь вытянутых стеклянных капилляров и закрепите эпоксидным клеем, обнажив только небольшую часть кончика электрода (Рисунок 1E). Это придает прочность тонким электродам и помогает надежно закрепить их в держателях электродов.
- Под микроскопом расположите стимулирующий электрод (электроды) в лужайком слоях области CA1 для стимуляции коллатеральных волокон Шаффера и регистрирующий электрод в апикальной дендритной области CA1 для регистрации ответов полевого EPSP (fEPSP).
заметка: Приближение электродов к поверхности жидкости над срезом дает звук, который помогает быстро определить местоположение поверхности среза (при условии, что усилитель подключен к громкоговорителю).
- В экспериментах по синаптическому мечению и захвату, в зависимости от необходимости эксперимента, расположите два или три стимулирующих электрода (S1, S2 или S3) по обе стороны от записывающего электрода, чтобы стимулировать два или более независимых, но перекрывающихся входа. Расположите стимулирующие и регистрирующие электроды на расстоянии около 200 мкм друг от друга.
- При необходимости найдите еще один регистрирующий электрод в слое пирамидального слоя для регистрации всплеска популяции (рисунок 2A). Когда оба электрода коснулись среза, с помощью программного обеспечения для сбора данных проведите тестовую стимуляцию, чтобы обеспечить правильный сигнал fEPSP.
заметка: Для тестовой стимуляции мы используем двухфазные импульсы постоянного тока (длительность импульса 0,1 мс/полуволна).
- Как только будет получен правильный сигнал fEPSP, осторожно опустите электроды на глубину около 200 мкм с помощью ручек тонкого движения манипуляторов. Подождите 20 минут, чтобы ломтики восстановились.
- Отношение «вход-выпуск»
- Определите соотношение вход-выход (афферентная стимуляция и наклон fEPSP) для каждого входа, измерив значение наклона в диапазоне интенсивностей тока. Выполняйте это действие в диапазоне от 20 мкА до 100 мкА. Затем установите интенсивность стимуляции для каждого входа, чтобы получить 40% от максимального наклона fEPSP. Сохраняйте это значение постоянным на протяжении всего эксперимента.
- Через 15-20 минут начните записывать базовый уровень. Внимательно отслеживайте наклон fEPSP в течение этого периода и сбросьте интенсивность стимула, если наклон колеблется более чем на 10% от заданного значения, и начните новую базовую линию. Прежде чем продолжить, запишите стабильный исходный уровень не менее чем за 30 минут или 1 час.
заметка: Для тестовой или базовой стимуляции мы используем четыре развертки двухфазных импульсов постоянного тока с частотой 0,2 Гц (0,1 мс на полярность), подаваемых каждые 5 минут. Средний наклон этих четырех реакций затем рассматривается как один повтор. Сигналы фильтруются и усиливаются дифференциальным усилителем, оцифровываются с помощью аналого-цифрового преобразователя и контролируются в режиме онлайн с помощью специально разработанного программного обеспечения.
