Обнаружение физиологических реакций сенсорных нейронов у дрозофил

1. Подготовка образцов

1. Пересеките линию водителя Gal4 к UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster летит (w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Дайте кроссу расти при температуре 25 °C.
   заметка: Генерация мух с несколькими копиями трансгенов Gal4 или UAS-GCaMP может помочь увеличить интенсивность флуоресцентного сигнала. Более ранняя версия трансгена UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) показала очень слабую интенсивность флуоресценции при экспрессии под контролем драйвера Gr68a-Gal4.
   1. Собрать и отделить по половому признаку вновь закрытых взрослых мух и вырастить при температуре 25 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный уровень флуоресценции GCaMP5G является оптимальным для мух в возрасте от 14 до 28 дней. Выделение мух по половому признаку исключает возможность социальных взаимодействий, которые могут влиять на нейронные реакции.
2. Обезболите муху под слабой струей CO₂.
3. Прикрепите ширинку к стеклянному покровному листу, предварительно поместив небольшую каплю лака для ногтей в центр покровного стекла диаметром 0,17 мм. Аккуратно положите на бок муху на каплю прозрачного лака для ногтей и следите за тем, чтобы муха покрывала всю каплю.
4. Выполните шаги 1.5 и 1.6 под препарирующим стереомикроскопом, используемым при 8-кратном увеличении.
5. Используйте влажную кисть, чтобы удлинить переднюю лапу мухи. Закрепите переднюю лапу в нужном положении, наложив две тонкие полоски ленты на первый и пятый сегменты предплюсны (рисунок 1A). При этом сегменты предплюсневых сегментов T2-T4 будут обнажены для визуализации (рис. 1B).
6. Чтобы получить изображение нейронов на хоботке, наложите тонкую полоску ленты на рострум хоботка, чтобы обнажить лабеллум (рис. 1C, D).
7. Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг мухи с помощью ручки PAP (пероксидаза-антипероксидаза), чтобы предотвратить растекание раствора по поверхности покровного стекла. Измерьте в течение 30 минут после монтажа.

2. Приготовление раздражителя

1. Разведите липофильные лиганды (такие как CH₅0₃, используемые в данном исследовании) в растворе PBST (фосфатно-солевой буфер с Triton X-100): 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 1,8 мМ KH₂PO₄, 0,1% Triton X-100 (v/v); pH 7,4.
   1. Приготовьте стоковый раствор лиганда в дозе 1 мг/мл с использованием PBST. Все последующие разведения исходного раствора готовить с помощью PBST.
      заметка: В зависимости от растворимости исследуемого лиганда для его растворения могут потребоваться различные растворители. В таблице 1 приведена информация о растворимости CH₅0₃ в различных растворителях. В отличие от других растворителей, PBST не увеличивал флуоресценцию.

3. Стимуляция вкусовых нейронов и получение изображений

1. С помощью пипеттора объемом 10 мкл нанесите 10 мкл PBST на тарзальные сегменты.
   заметка: Этот шаг увлажняет ногу и предотвращает смещение предплюсневых сегментов.
2. Используйте оптическую систему, которая имеет камеру с достаточной скоростью и чувствительностью для достижения хорошего флуоресцентного сигнала при высоком временном разрешении.
   заметка: Для этого исследования мы использовали конфокальный микроскоп с вращающимся диском и камеру sCMOS (см. Список материалов).
3. Выберите конкретный сегмент предплюсны и нейроны для визуализации. Приобретите три конфокальных Z-стека для предварительной стимуляции.
   1. В идеале следует использовать достаточно быстрые настройки сбора данных, чтобы обеспечить максимальное временное разрешение, сохраняя при этом захват всего объема ячейки. Примеры настроек захвата: экспозиция 200 мс, объединение оптических секций 2 x 2 и 6 x 0,5 м2, захватываемых каждые 2 сек< чел./> ПРИМЕЧАНИЕ: Иммобилизованные ноги были успешно визуализированы в течение 10 минут, с интервалом в 30 секунд, без заметного обесцвечивания сигнала GCaMP. Для более длительного времени записи убедитесь, что ножки очень прочно удерживаются на покровном листе.
   2. Оптимизируйте мощность лазера для достижения максимально возможного соотношения сигнал/шум с минимальным фотообесцвечиванием в течение всего режима визуализации. Для описанных здесь экспериментов используйте диодный лазер с длиной волны 491 нм (100 мВт) при 30% пропускании для визуализации вкусовых нейронов Gr68a и ppk23 на ногах и хоботке. Используйте группирование 2 x 2, чтобы сократить время экспозиции, при этом достигнув достаточного пространственного разрешения.
      заметка: Настройки мощности лазера были оптимизированы для обнаружения изменений флуоресценции в диапазоне от 1,2 до 4,5 раза.
4. Пипеткой нанесите 10 мкл стимулирующего раствора на тарзальные сегменты. Добавьте еще 10 мкл PBST для контрольных экспериментов. Немедленно получите 117 изображений после стимуляции.
   заметка: Количество полученных изображений после стимуляции основано на времени, затраченном на достижение максимального изменения флуоресценции (примерно 2 минуты).
   1. КРИТИЧЕСКИЙ ЭТАП: При пипетировании раствора на препарате не прикасайтесь к мухе кончиком пипетки, так как это приведет к смещению передней ноги.
      заметка: В качестве альтернативы можно использовать микроманипулятор для точного позиционирования стеклянного капилляра, содержащего стимул, рядом с исследуемым сегментом предплюсны. Подавайте контролируемые объемы раздражителя с помощью дозатора для внутриклеточных микроинъекций в соответствии с инструкциями производителя.

Рисунок 1: Установка живой мухи для визуализации нейронов передней ноги или хоботка. (A) Установка передней лапы: 3,2-кратное изображение живого самца мухи, показывающее передние лапы, прикрепленные к покровному листу с помощью ленты. (B) На 40-кратном изображении мухи показан каждый из сегментов предплюсны (T1-5) и размещение ленты над первым сегментом предплюсны и на пятом сегменте предплюсны. (C) Монтаж хоботка: кусок ленты помещается поверх рострума, чтобы обнажить кончик хоботка. (D) Наконечник пипетки для добавления стимула держится немного над мухой и не вступает в прямой контакт с препаратом.

Таблица 1: Растворимость CH503 в различных растворителях. ДМСО: Диметилсульфоксид. Растворы этанола, гексана и ДМСО разбавляли dH2O (v/v). Растворимость CH503 в 0,2% ДМСО была ограничена только 250 нг/мл. Увеличение ΔF/F только при использовании растворителя было эквивалентно тому, которое наблюдалось при стимуляции феромонами.