Оптогенетическая стимуляция и электрофизиологическая регистрация синаптических событий в срезах мозга крыс

Аннотация

Источник: Kinnavane, L., et al. ex vivo оптогенетическое исследование дальней синаптической передачи и пластичности от медиальной префронтальной коры к латеральной энторинальной коре. J. Vis. Exp. (2022)

Это видео демонстрирует процедуру изучения синаптической эффективности в латеральной энторинальной коре (LEC) с помощью оптогенетически стимулирующих аксонов медиальной префронтальной коры (mPFC) и записи ответов пирамидных нейронов в LEC. Этот метод сочетает в себе патч-клэмпинговые записи с синаптической активацией с помощью световой стимуляции для изучения синаптической пластичности.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Электрофизиология и оптогенетическая стимуляция

1. Идентификация целевой клетки.
   1. Поместите срез в погружную записывающую камеру при температуре 34 °C, перфузированную искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF) со скоростью 2 мл/мин с помощью перистальтического насоса. Обездвижите срез с помощью анкера для среза.
   2. Под объективом с малым увеличением (4x) широкопольного микроскопа с использованием косого инфракрасного излучения перейдите к слою 5 латеральной энторинальной коры (LEC). Измерьте расстояние от поверхности пиала до необходимого слоя.
      заметка: Наклонное инфракрасное освещение было достигнуто путем размещения ближнеинфракрасного светодиода примерно на 3 мм ниже покровного стекла записывающей камеры под углом ~55° к плоскости покровного стекла (рис. 1B). Дифференциальный интерференционный контраст является альтернативным и широко используемым методом визуализации для электрофизиологии срезов.
   3. Перейдите на объектив для погружения в воду с большим увеличением (40x) и определите пирамидальные нейроны. Отметьте положение ячейки на мониторе компьютера скотчем.
      заметка: Пирамидальные нейроны имеют примерно треугольную морфологию с выступающими апикальными дендритами, выступающими к пиальной поверхности среза (рис. 2A). Здоровье клетки можно оценить по отсутствию конденсированного видимого ядра и осмотру плазматической мембраны, которая должна казаться гладкой. Маловероятно, что при использовании широкопольного флуоресцентного микроскопа будет видно четкое флуоресцентное мечение аксонов белком-слиянием опсин-флуорофор. Чтобы визуализировать аксональные проекции, проведите иммуногистохимию постфактум с использованием первичного антитела против флуорофора опсина и амплифицируйте вторичным антителом, конъюгированным с флуорофором той же или аналогичной длины волны.
2. Формирование цельноклеточного патч-зажима.​
   1. Изготовьте микропипетку из боросиликатного стекла с помощью пуллера для пипетки и заполните ее фильтрованным раствором для внутриклеточной записи (120 мМ k-глюконата, 40 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота), 10 мМ KCl (хлорид калия), 2 мМ NaCl (хлорид натрия), 2 мМ MgATP (аденозинтрифосфат магния), 1 мМ MgCl (хлорид магния), 0,3 мМ NaGTP (гуанозинтрифосфат натрия), 0,2 мМ EGTA (этиленгликоль тетрауксусная кислота), и 0,25% биоцитина, полученного в UPW (сверхчистая вода), pH 7,25, 285-300 mOsm). Поместите заполненную микропипетку в держатель электродов на верхней части усилителя с патч-хомутами, убедившись, что электродный провод находится в контакте с внутриклеточным раствором.
   2. Надавливайте положительное давление ртом, сильно дуя в мундштук (например, в шприц объемом 1 мл со снятым поршнем), соединенный трубкой со боковым портом держателя электродов, и поддерживайте давление, закрывая встроенный трехходовой клапан. Поднимите объектив микроскопа так, чтобы образовался мениск, и вставьте электрод в мениск до тех пор, пока он не будет виден на микроскопе.
   3. Откройте окно Seal Test в WinLTP16 (или другом программном обеспечении/осциллографе для сбора данных) и, когда усилитель находится в режиме напряжения-зажима, подайте квадратный импульс 5 мВ, чтобы определить, составляет ли сопротивление пипетки 3–6 МОм.
   4. Подойдите к идентифицированной клетке и коснитесь ее кончиком пипетки; это должно привести к образованию углубления в клеточной мембране (рис. 2A; правая панель) и небольшому увеличению сопротивления пипетки (0,1 МОм).
   5. Сбросьте положительное давление и приложите отрицательное давление, применяя умеренное всасывание в мундштуке; это должно привести к значительному увеличению сопротивления пипетки (>1000 МОм). Давление теперь можно оставить нейтральным. Применяйте отрицательное давление в постепенно увеличивающемся нарастающем нарастании до тех пор, пока клеточная мембрана не разорвется, что приведет к переходным процессам емкости всей клетки.
3. Записывать оптогенетически вызванные синаптические события.
   1. Введите конфигурацию токоизмерительных клещей.
      Примечание: В большинстве случаев синаптическая передача на большие расстояния является глутаматергической, поэтому запись на мембранных потенциалах, близких к потенциалу обращения хлоридов, наилучшим образом изолирует передачу, опосредованную рецептором AMPA (AMPAR), и сводит к минимуму измерение любого вызванного ингибирования прямой связи (FFI). Реверсирование хлорида зависит от состава внутриклеточного регистрирующего раствора и aCSF и может быть рассчитано с использованием уравнения Голдмана-Ходжкина-Каца; для вышеуказанных решений это составило -61,3 мВ. Пирамидальные нейроны LEC слоя 5 имели средний мембранный потенциал покоя -62 мВ и, при необходимости, поддерживались на этом уровне за счет инжекции постоянного тока. В качестве альтернативы элементы могут быть ограничены напряжением до желаемого потенциала. Для регистрации ингибирующих проекций на большие расстояния16 или для регистрации FFI напряжение-зажим на потенциале обращения катионов для изоляции проводимости ГАМКергических хлоридов. Когда потенциал-зажимы нейронов напряжения находятся с потенциалами выше порога потенциалов действия, для улучшения потенциал-зажима и предотвращения инициации потенциальных потенциалов потенциал-фиксации потенциал-фиксаторов натриевых каналов используется внутриклеточный раствор на основе цезия, содержащий потенциал-зависимые блокаторы натриевых каналов (130 мМ CsMeSO4 (цезийметансульфонат), 10 мМ HEPES, 8 мМ NaCl, 5 мМ хлорида QX 314, 4 мМ MgATP, 0,5 мМ EGTA, 0,3 мМ NaGTP, 0,25% биоцитина, полученного в UPW, рН 7,25, 285-300 мОсм).
   2. Используя программное обеспечение для сбора данных, отправьте транзисторно-транзисторные логические сигналы (TTL) на драйвер светодиода (светоизлучающего диода) для активации установленного светодиода с длиной волны 470 нм. Установленный светодиод направляется в световой путь микроскопа с помощью фильтровальных кубов и соответствующей оптики (рис. 1B) для подачи световых импульсов на срез через объектив 40x для вызова оптогенетических возбуждающих постсинаптических потенциалов (oEPSP).
      заметка: Световые импульсы могут подаваться перисоматически/над дендритами, что приведет к активации опсинов в аксонах и пресинаптических бутонах, или исследователь может переместить объектив на аксоны от записанной клетки, чтобы избежать чрезмерной стимуляции. Максимальная амплитуда oEPSP зависит от силы синаптической проекции, эффективности вирусных инъекций и используемого опсина. oEPSP можно титровать до желаемой амплитуды путем изменения интенсивности и/или продолжительности света18; Изменение длительности световых импульсов (типичная продолжительность от 0,2 до 5 мс при максимальной выходной мощности светодиода, что приводит к плотности света 4,4 мВт/мм19) дает более стабильные амплитуды oEPSP, чем изменение выходной мощности светодиода.
   3. Исследуйте свойства пресинаптического высвобождения (изменения напряжения) путем подачи последовательностей множественных световых импульсов с различными межпространными интервалами (рис. 2E); следует проявлять осторожность при интерпретации оптогенетически вызванной передачи.
   4. Исследуйте долгосрочную пластичность либо путем повторного вызова oEPSPs19, либо путем применения лигандов. Контролируйте амплитуду oEPSP в течение 5-10 минут, чтобы обеспечить стабильность до индукции пластичности, а затем контролируйте до тех пор, пока не будет достигнута стабильная амплитуда (обычно 30-40 минут).
      заметка: Большинство современных опсинов не способны надежно вызывать множественные потенциалы действия на высоких частотах, например, 100 стимулов, доставляемых с частотой 100 Гц, как это обычно используется для индуцирования LTP.
   5. Чтобы подтвердить, что oEPSP являются моносинаптическими, выполните сверхбутонную активацию трансдуцированного пути, расположив объектив над дендритным выступом и стимулируя в присутствии 0,5 мкМ тетродотоксина и 100 мкМ аминопиридина. Применение тетродотоксина упразднит трансмиссию, если реакции зависят от потенциала действия, а последующее включение аминопиридина частично восстановит передачу, если oEPSP генерируются моносинаптически 19,20.
   6. Чтобы биоцитин заполнил нейрон, подождите не менее 15 минут после входа в конфигурацию всей клетки. В потенциал-клещи контролируйте емкость мембраны и входное сопротивление.
   7. Медленно отведите пипетку по углу подхода от сомы клетки, наблюдая за медленным исчезновением емкостных переходных процессов и мембранного тока, указывающих на повторное герметизацию клеточной мембраны и образование внешнего участка на кончике пипетки. Обратите внимание на ориентацию среза и расположение ячеек внутри среза. Поместите ломтик в PFA (параформальдегид) в 24-луночный планшет, инкубируйте в течение ночи при 4 °C, а затем перенесите до 0,1 М PB.
      заметка: Ломтики могут храниться до недели. Если требуется более длительное хранение, регулярно меняйте ПБ (фосфатный буфер) или используйте ПБ, содержащий азид натрия (0,02%-0,2% от азида натрия).

Результаты

Рисунок 1: Камера для сбора срезов и оптическая конфигурация для визуализируемых записей целых клеток, оптогенетического возбуждения и идентификации tdTomato-положительных нейронов. (A) Камера для сбора срезов14 изготовлена на заказ из микроцентрифужного штатива для пробирок, наклеенного на лист нейлоновой сетки и помещенного в стакан, в который она погружена в aCSF (B

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3-ходовой клапан Люэра	Коул-Пармер	ВЗ-30600-02
Объектив 40x	Олимп	LUMPLFLN40XW
4-аминопиридин	Здравствуйте Биография	НВ1073
Цель 4x	Олимп	PLN4X/0,1
Ахроматический хрусталик	Эдмунд Оптикс	No 49363	Фокусирует визуальный спектр и ближний инфракрасный диапазон
Настольная микроцентрифуга	Бенчмарк Научная	С1005*
Биоцитин	Сигма-Олдрич	В4261
Капилляр боросилликатного стекла	Уорнер Инструментс	Г150Ф-6
CaCl2	Сигма-Олдрич	С5670
Фотоаппарат - Qimaging Retiga Electro	Фотометрия	01-ЭЛЕКТРО-М-14-С
Карбахол	Токрис	2810
Хирургический скраб с хлоргексидином	Ветасепт	ХГГ008
Ножницы	Андис	No 22445	AGC Super 2-скоростной машинка для стрижки съемных лезвий
Коллимационная конденсорная линза	ТорЛабс	ACL2520-А
Покровные стекла	Фишер Сайентиал Лтд	10011913
криостат	Лейка	КМ3050 С
CsMeSO4	Сигма-Олдрич	С1426
Цианоакрилатный клей	Рапид Электроникс Лтд	84-4557
Устройство сбора данных	Национальные инструменты	USB-6341 BNC
D-глюкоза	Сигма-Олдрич	Г8270
Дихроичное зеркало 500 нм длиннопроходное	Эдмунд Оптикс	No 69899
Дихроичное зеркало 600 нм длиннопроходное	Эдмунд Оптикс	69901
Дихроичный зеркальный куб	ТорЛабс	КМ1-ДЧ/М
ЭГТА	Миллпор	324626
Держатель электродов с боковым портом	ХЕКА	895150 Телефонный знак 895150
Фильтр эмиссии	Цветность	59022м
Фильтр возбуждения	Цветность	ET570/20x
Гель для глаз	Дехра	Лубритал
Тонкая кисть для рисования	Расходные материалы для научных лабораторий	BRU2052
гильотина	Мировые прецизионные приборы	ДКАП
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич	Н3375
Раствор перекиси водорода	Сигма-Олдрич	Н1009	30% (по масу)
Изофлуран	Генри Шейн	988-3245 (английский)
Изопентан	Сигма-Олдрич	М32631
KCl	Сигма-Олдрич	П3911
К-глюконат	Сигма-Олдрич	Г4500
Куб кинематического флуоресцентного фильтра	ТорЛабс	ДФМ1Т1
Светодиодный драйвер	ТорЛабс	СВЕТОДИОД1Б
МгАТФ	Сигма-Олдрич	А9187
MgCl	Сигма-Олдрич	М2670
MgSO4	Сигма-Олдрич	М7506
Съемник микроэлектродов	Инструменты Саттера	-87
Шприц для микроинъекций	Гамильтон	7634-01/00
Игла шприца для микроинъекций	Гамильтон	7803-05	Индивидуальные характеристики: калибр 33, длина 15 мм, тип острия 4 - 12°
Шприцевой насос для микроинъекций	Мировые прецизионные приборы	УМП3Т-1
Встроенный синий светодиод	ТорЛабс	М470Л5
Na2HPO4.7H2O	Сигма-Олдрич	С9390
NaCl	Сигма-Олдрич	С9888
НаГТП	Сигма-Олдрич	Г8877
НаН2ПО4	Сигма-Олдрич	С0751
NaH2PO4.H2O	Сигма-Олдрич	С9638
NaHCO3	Сигма-Олдрич	С5761
Светодиод NIR	Компания OSRAM	SFH4550	Дифференциально-интерференционно-контрастная оптика (DIC), используемая для преломленной инфракрасной визуализации среза, является еще одним широко используемым методом
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	158127
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	П6148
Усилитель патч-клещей	Молекулярные приборы	700А
Перистальтический насос	Мировые прецизионные приборы	Министар
Предметные стекла микроскопа с поли-L-лизиновым покрытием	Фишер Сайентиал Лтд	Тел.: 23-769-310
Записывающая камера	Уорнер Инструментс	РК-26Г
Нарезать якорь	Уорнер Инструментс	ШД-26-ГГ/15
Стереотаксический держатель для микродрели	Гарвардский аппарат	75-1874
сахароза	Сигма-Олдрич	С0389
Хирургический микроскоп	Карл Цейсс	OPMI 1 FR pro
Шприцевой фильтр для внутриклеточной записи	Компания Thermo Scientific Nalgene	171-0020
Вертикальный флуоресцентный микроскоп	Лейка	ДМ6 В
решение
ФКСФ
раствор для резки сахарозы
ПФА