Загрузка и разгрузка микроэлектродного FM-красителя в нервных клетках личинок дрозофилы

Аннотация

Источник: Kopke, D. L., et al., FM цикл красителя в синапсе: сравнение высокой деполяризации калия, электрической и канальной стимуляции родопсина. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео нервные волокна личинок дрозофилы погружены в FM-краситель, который связывается с липидами клеточной мембраны. Всасывающий микроэлектрод и электрические импульсы стимулируют процесс эндоцитоза, встраивая краситель FM во вновь образованные эндоцитарные везикулы. Этот метод, который визуализирует пресинаптические стадии нейротрансмиссии, полезен для изучения синаптической функции и высвобождения нейротрансмиттеров.

Протокол

1. Вскрытие личиночного клея

1. Тщательно перемешайте 10 частей силиконовой эластомерной основы с 1 частью силиконового эластомерного отвердителя из набора эластомеров.
2. Покройте стекло 22 x 22 мм эластомером и отверждайте на горячей плите при температуре 75 °C в течение нескольких часов (до тех пор, пока он не перестанет быть липким на ощупь).
3. Поместите одну стеклянную покровную крышку с эластомерным покрытием в специально изготовленную камеру для вскрытия плексигласа для вскрытия личинок.
4. Приготовьте клеевые пипетки из капилляров из боросиликатного стекла с помощью стандартного съемника микроэлектродов для получения желаемой конусности и размера наконечника.
5. Аккуратно отломите наконечник микропипетки и прикрепите к другому концу гибкую пластиковую трубку длиной 2 фута (внутренний диаметр 1/32 дюйма, внутренний диаметр; внешний диаметр 3/32 дюйма, внешний диаметр; наружный диаметр 1/32 дюйма; стенка 1/32 дюйма; с зажимом (наконечник пипетки P2).
6. При подготовке к вскрытию личинок заполните небольшую емкость (крышка пробирки Eppendorf объемом 0,6 мл) небольшим объемом (~20 мкл) клея.
7. Заполните камеру физиологическим раствором (в мМ): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl₂, 70 сахарозой и 5 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислотой (HEPES) pH 7,2.
8. Добавьте антитело против пероксидазы хренской редьки (HRP), конъюгированное с Alexa Fluor 647 (анти-HRP:647; разбавляйте 1:10 из 1 мг/мл) для мечения пресинаптической окончания NMJ во время диссекции21,22.
9. С помощью тонкой кисти (размер 2) удалите блуждающий третий возраст из флакона с едой и поместите его на покровное стекло, покрытое эластомером.
10. Заполните стеклянный наконечник микропипетки небольшим объемом клея с использованием отрицательного давления воздуха, создаваемого ртом с насадкой (шаг 1.5).
11. Расположите личинку спинной стороной вверх щипцами и приклейте голову к покрытому эластомером покровному листу небольшой каплей клея, используя положительное давление воздуха ртом.
12. Повторите эту процедуру с задним концом личинки, убедившись, что животное натянуто натянуто между двумя клеевыми креплениями.
13. С помощью ножниц (лезвия 3 мм) сделайте горизонтальный разрез (~1 мм) сзади и вертикальный разрез по всей спинной средней линии.
14. С помощью тонких щипцов (#1) аккуратно удалите тыльную часть трахеи, кишечник, жировое тело и другие внутренние органы, покрывающие мускулатуру.
15. Повторите процедуру склеивания четырех клапанов стенки тела; аккуратно растяните стенку корпуса по горизонтали и вертикали.
16. Подтяните вентральный нервный канатик (ВНК) с помощью щипцов, аккуратно перережьте ножницами двигательные нервы, а затем полностью удалите ВНК.
17. Чтобы остановить цикличность SV, замените диссекционный физиологический раствор на безсолевой раствор Ca²⁺ (такой же, как и вышеуказанный диссекционный физиологический раствор без CaCl₂).

2. Электростимуляция FM Загрузка красителя

1. Подготовьте отсасывающую пипетку с помощью съемника микроэлектродов для получения требуемого размера конуса и наконечника.
2. Отполируйте наконечник микроэлектрода с помощью микроковки до тех пор, пока один двигательный нерв не сможет быть затянут с плотной посадкой.
3. Наденьте отсасывающую пипетку на держатель электрода на микроманипуляторе и прикрепите ее к длинной гибкой пластиковой трубке и шприцу.
4. Установите параметры стимулятора (например, 15 В, частоту 20 Гц, продолжительность 20 мс и время 5 мин или 1 мин.
5. Замените свободный от Ca²⁺ физиологический раствор в личиночном препарате на вышеуказанный физиологический раствор FM1-43 (4 мкМ; 1 мМ CaCl₂) в электрофизиологической установке.
6. Поместите препарат на предметный столик для микроскопа и поднимайте его до тех пор, пока личинка и всасывающая пипетка не сфокусируются (объектив погружения в воду 40X).
7. Всасывайте петлю перерезанного двигательного нерва, иннервирующего выбранный полусегмент отрицательным давлением воздуха, создаваемым шприцем, в отсасывающий электрод.
8. Проверьте функцию всасывающего электрода с помощью короткого всплеска стимуляции, визуально контролируя сокращение мышц в выбранном полусегменте.
9. Стимулируйте двигательный нерв с использованием выбранных параметров (шаг 2.4) для управления эндоцитозом SV и поглощением красителя FM1-43.
10. Быстро вымойте солевым раствором без Ca²⁺ (5 раз в течение 1 минуты), чтобы полностью удалить раствор красителя FM1-43.
11. Поддерживайте личиночный препарат в свежем физрастворе без Ca²⁺ для немедленной визуализации с использованием протокола конфокальной визуализации, приведенного выше.
12. Внимательно запишите изображение NMJ (сегмент, бок и мышца), чтобы обеспечить доступ к тому же NMJ после выгрузки FM-красителя.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
SylGard 184 Набор силиконовых эластомеров	Научный центр Фишера	NC9644388	Для надевания на покровное стекло для вскрытия
Покровное стекло для микроскопа 22x22-1	Фишербранд	12-542-Б	Чтобы надеть SylGard для вскрытия
Алюминиевая верхняя конфорка типа 2200	Термолин	HPA2235M	Чтобы вылечить СилГард
Камера для рассечения плексигласом	Н/Д	Н/Д	ручной работы
Капилляры боросиликатного стекла	ВПИ	1В100Ф-4	Для изготовления отсоса и склеивания микропипетки
Лазерный съемник микропипеток	Инструмент Саттера	-2000	Для изготовления отсоса и склеивания микропипетки
Лабораторные трубки Tygon E-3603	Компания по поставке компонентов	ТЕТ-031А	Для рта и отсасывающей пипетки
Наконечник для пипетки P2	США Сайентифик	1111-3700 (Английский)	Для ротовой пипетки
Крышка пробирки Eppendorf 0,6 мл	Научный центр Фишера	Тел.: 05-408-120	Используется для нанесения клея для вскрытия
Ветбонд 3М	ВПИ	Ветбонд	Клей, используемый для вскрытия
Хлористый калий	Научный центр Фишера	-217	Форсалин
Хлорид натрия	Миллипора Сигма	С5886	Для солевого раствора
Хлорид магния	Научный центр Фишера	М35-500	Для солевого раствора
Дигидрат хлорида кальция	Миллипора Сигма	С7902	Для солевого раствора
сахароза	Научный центр Фишера	С5-3	Для солевого раствора
ХЕПЕС	Миллипора Сигма	Н3375	Для солевого раствора
HRP: Alexa Fluor 647	Иммуноисследования Джексона	Тел.: 123-605-021	Для маркировки мембран нейронов
кисть	Уинзор и Ньютон	94376864793	Для манипуляций с личинками
Пинцет Dumont Dumostar #5	ВПИ	500233	Используется во время вскрытия
Микроножницы McPherson-Vannas 7 см (лезвия 3 мм)	ВПИ	14177	Используется во время вскрытия
ФМ1-43	Научный центр Фишера	Т35356	Флуоресцентный стириловый краситель
Цифровой таймер	ВВР	Тел.: 62344-641	Для синхронизации загрузки/выгрузки FM-красителя
Микрокузница	ВПИ	МФ200	Для огневой полировки стеклянных микропипеток
20 мл шприца с скользящим наконечником	БД	301625	Всасывать аксон для электростимуляции.
Микроманипулятор (магнитное основание)	Нарисигэ	ММН-9	Для управления всасывающим электродом для электростимуляции
стимулятор	трава	С48	Для управления светодиодной и электрической стимуляцией
Микроскоп Zeiss Axioskop	Цейсс		Используется во время электростимуляции.
40-кратный объектив для погружения в воду Achroplan	Цейсс		Используется во время электростимуляции и конфокальной визуализации
Микроскоп Zeiss Stemi с портом для камеры	Цейсс	2000-С	Используется во время стимуляции каналродопсина
Светодиодный драйвер T-Cube	ТорЛабс	СВЕТОДИОД1Б	Для управления светодиодом
Светодиодный блок питания	Компания «Цинкон Электроникс»	TR15RA150	Для питания светодиода
Измеритель оптической мощности и энергии	ТорЛабс	ПМ100Д	Для измерения интенсивности светодиодов