Методическая статья

Анализ переработки синаптических везикул и поглощения флуоресцентного красителя личинками дрозофилы

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Kopke, D. L., et al., FM Циклизация красителя в синапсе: сравнение высокой деполяризации калия, электрической и канальной стимуляции родопсином. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует протокол изучения переработки синаптических везикул в нервно-мышечных соединениях личинок дрозофилы, экспрессирующих родродопсин, с использованием флуоресцентного красителя. Синий свет активирует каналродопсины, вызывая приток кальция и экзоцитоз синаптических везикул. Краситель интегрируется в мембраны нейронов и интернализуется во время эндоцитоза, что приводит к усилению флуоресценции. Дальнейшая стимуляция синим светом индуцирует экзоцитоз и высвобождение красителя, что проявляется в снижении флуоресценции.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Вскрытие личиночного клея

  1. Тщательно смешайте 10 частей основы из силиконового эластомера с 1 частью отвердителя силиконового эластомера из набора эластомеров (Таблица материалов).
  2. Покройте стекло 22 x 22 мм эластомером и отверждайте на горячей плите при температуре 75 °C в течение нескольких часов (до тех пор, пока он не перестанет быть липким на ощупь).
  3. Поместите одну стеклянную покровную крышку с эластомерным покрытием в специально изготовленную камеру для вскрытия плексигласа (Рисунок 1, внизу) для подготовки к вскрытию личинок.
  4. Приготовьте клеевые пипетки из капилляров из боросиликатного стекла с помощью стандартного съемника микроэлектродов для получения желаемой конусности и размера наконечника.
  5. Аккуратно отломите наконечник микропипетки и к другому концу прикрепите 2 фута гибкой пластиковой трубки (внутренний диаметр 1/32 дюйма, внутренний диаметр; внешний диаметр 3/32 дюйма, внешний диаметр; наружный диаметр 1/32 дюйма; стенка 1/32 дюйма; Таблица материалов) с ротовым штуцером (наконечник пипетки P2).
  6. Заполните небольшой контейнер (0,6 мл крышки пробирки Eppendorf) небольшим объемом (~20 мкл) клея (Таблица материалов) при подготовке к вскрытию личинок.
  7. Заполните камеру физиологическим раствором (в мМ): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 сахарозой и 5 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислотой (HEPES) pH 7,2.
  8. Добавьте антитело против пероксидазы хренской редьки (HRP), конъюгированное с Alexa Fluor 647 (анти-HRP:647; разведите 1:10 из 1 мг/мл) для мечения пресинаптического терминаля нервно-мышечного соединения (NMJ) во время диссекции.
  9. С помощью тонкой кисти (размер 2) извлеките блуждающую личинку третьего возраста из флакона с пищей и поместите ее на покровное стекло, покрытое эластомером.
  10. Заполните стеклянный наконечник микропипетки небольшим объемом клея с помощью отрицательного давления воздуха, создаваемого ртом с насадкой (шаг 1.5).
  11. Расположите личинку спинной стороной вверх щипцами и приклейте голову к покрытому эластомером покровному листу небольшой каплей клея с помощью положительного давления воздуха ртом.
  12. Повторите эту процедуру с задним концом личинки, следя за тем, чтобы животное было натянуто натянуто между двумя клеевыми креплениями.
  13. С помощью ножниц (лезвия 3 мм; Таблица материалов), сделайте горизонтальный разрез (~1 мм) сзади и вертикальный разрез по всей спинной средней линии.
  14. С помощью тонких щипцов (#5, Таблица материалов) аккуратно удалите тыльную сторону трахеи, кишечника, жирового тела и других внутренних органов, покрывающих мускулатуру.
  15. Повторите процедуру склеивания четырех створок стенки корпуса, аккуратно растягивая стенку корпуса как по горизонтали, так и по вертикали.
  16. Поднимите вентральный нервный канатик (ВНК) с помощью щипцов, аккуратно перережьте ножницами двигательные нервы, а затем полностью удалите ВНК.
  17. Замените диссекционный физиологический раствор на свободный от Ca2+ физиологический раствор (такой же, как и вышеуказанный диссекционный раствор без CaCl2), чтобы остановить цикл синаптических везикул (SV).

2. Визуализация: конфокальная микроскопия

  1. Используйте вертикальный конфокальный микроскоп с 40-кратным объективом для измерения флуоресценции красителя NMJ (можно использовать и другие микроскопы).
  2. Сфотографируйте мышцы 4 NMJ брюшных сегментов 2-4 (можно визуализировать и другие NMJ) и соберите изображения с помощью соответствующего программного обеспечения (Table of Materials).
  3. Используйте гелий-неоновый лазер 633 нм для возбуждения HRP:647 (с длинночастотным фильтром > 635 нм) и аргоновый лазер 488 нм для возбуждения FM1-43 (с полосовым фильтром 530-600 нм).
  4. Оперативное определение оптимального усиления и смещения для обоих каналов.
    заметка: Эти настройки останутся неизменными на протяжении оставшейся части эксперимента.
  5. Проведите конфокальный Z-стек через всю выбранную NMJ от отмеченной HRP верхней и нижней части синаптической окончании.
  6. Внимательно обратите внимание на изображенный NMJ (сегмент, бок и мышца), чтобы убедиться в избытке точно такого же NMJ после выгрузки FM-красителя.

3. Загрузка красителя для стимуляции родродопсина FM

  1. Выращивать личинки, экспрессирующие ChR2, на пище, содержащей кофактор ChR2 all-trans-ретиналь (растворенный в этаноле; конечная концентрация 100 мкМ).
  2. Поместите личиночный препарат в камеру из оргстекла на предметный столик для препарирования микроскопа, оборудованный портом для камеры.
  3. Подключите синий светодиод (470 нм; Таблица материалов) к программируемому стимулятору с помощью коаксиального кабеля и поместите светодиод в порт камеры.
  4. Сфокусируйте синий светодиодный луч света на рассеченной личинке с помощью функции масштабирования микроскопа.
  5. Замените свободный от Ca2+ физиологический раствор в личиночном препарате физиологическим раствором выше FM1-43 (4 мкМ; 1 мМ CaCl2) на оптогенетической стадии.
  6. Установите параметры светодиода с помощью стимулятора (например, 15 В, частота 20 Гц, продолжительность 20 мс и время 5 минут (рис. 2)).
  7. Запустите световую стимуляцию и отслеживайте с помощью таймера заданную продолжительность периода оптогенетической стимуляции (например, 5 минут; Рисунок 2).
  8. Когда таймер остановится, быстро удалите раствор красителя FM и замените его на безсолевой раствор Ca2+, чтобы остановить цикл SV.
  9. Быстро промойте раствором Ca2+ (5 раз в течение 1 минуты), чтобы полностью удалить раствор красителя FM.
  10. Препарат для личинок следует хранить в свежем физиологическом растворе, не содержащем Ca2+, для немедленной визуализации с помощью конфокального микроскопа с использованием протокола визуализации.
  11. Внимательно запишите изображенный NMJ (сегмент, бок и мышца), чтобы обеспечить доступ к точно такому же NMJ после выгрузки FM-красителя.

4. Стимуляция каналродопсина: разгрузка FM-красителя

  1. Замените безсолевой раствор Ca2+ на обычный физиологический раствор (без красителя FM1-43) на предметном столике микроскопа с светодиодом порта камеры, направленным на личинку.
  2. Установите параметры стимулятора для разгрузки (например, 15 В, частота 20 Гц, длительность 20 мс и время 2 минуты (рис. 2).
  3. Запустите световую стимуляцию и отслеживайте с помощью таймера заданную продолжительность периода оптогенетической стимуляции (например, 2 минуты; Рисунок 2).
  4. Когда период таймера истечет, быстро удалите раствор красителя FM и замените его на безсолевой раствор Ca2+, чтобы остановить цикл SV.
  5. Быстро умойте раствором без Ca2+ (5 раз в течение 1 минуты), чтобы убедиться, что внешний краситель полностью удален.
  6. Препарат для личинок следует хранить в свежем физиологическом растворе без Ca2+ для немедленной визуализации с помощью конфокального микроскопа.
  7. Убедитесь, что вы визуализируете флуоресценцию красителя FM1-43 в том же NMJ, о котором говорилось выше, используя те же конфокальные настройки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Блок-схема протокола загрузки красителя FM1-43 в NMJ дрозофилы. Расслоение личиночного клея приводит к образованию уплощенного нейромускулатурного препарата, при этом вентральный нервный канатик (VNC) проецирует сегментарные нервы от вентральной средней линии (Vm) к гемисегментарно повторяющимся мышечным массивам стенки тела (стадия a). VNC разрезают, а затем инкубируют всю личиночную дисс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
SylGard 184 Набор силиконовых эластомеровНаучный центр ФишераNC9644388Для надевания на покровное стекло для вскрытия
Покровное стекло для микроскопа 22x22-1Фишербранд12-542-БЧтобы надеть SylGard для вскрытия
Алюминиевая верхняя конфорка типа 2200ТермолинHPA2235MЧтобы вылечить СилГард
Камера для рассечения плексигласомН/ДН/Дручной работы
Капилляры боросиликатного стеклаВПИ1В100Ф-4Для изготовления отсоса и склеивания микропипетки
Лазерный съемник микропипетокИнструмент Саттера-2000Для изготовления отсоса и склеивания микропипетки
Лабораторные трубки Tygon E-3603Компания по поставке компонентовТЕТ-031АДля рта и отсасывающей пипетки
Наконечник для пипетки P2США Сайентифик1111-3700 (Английский)Для ротовой пипетки
Крышка пробирки Eppendorf 0,6 млНаучный центр ФишераТел.: 05-408-120Используется для нанесения клея для вскрытия
Ветбонд 3МВПИВетбондКлей, используемый для вскрытия
Хлористый калийНаучный центр Фишера-217Форсалин
Хлорид натрияМиллипора СигмаС5886Для солевого раствора
Хлорид магнияНаучный центр ФишераМ35-500Для солевого раствора
Дигидрат хлорида кальцияМиллипора СигмаС7902Для солевого раствора
сахарозаНаучный центр ФишераС5-3Для солевого раствора
HRP: Alexa Fluor 647Иммуноисследования ДжексонаТел.: 123-605-021Для маркировки мембран нейронов
ХЕПЕСМиллипора СигмаН3375Для солевого раствора
кистьУинзор и Ньютон94376864793Для манипуляций с личинками
Пинцет Dumont Dumostar #5ВПИ500233Используется во время вскрытия
Микроножницы McPherson-Vannas 7 см (лезвия 3 мм)ВПИ14177Используется во время вскрытия
ФМ1-43Научный центр ФишераТ35356Флуоресцентный стириловый краситель
Цифровой таймерВВРТел.: 62344-641Для синхронизации загрузки/выгрузки FM-красителя
LSM 510 META лазерно-сканирующий конфокальный микроскопЦейссДля визуализации флуоресцентных маркеров
Zen 2009 SP2 версия 6.0ЦейссПрограммное обеспечение для визуализации на конфокальных
HeNe лазер 633 нмЛасосДля возбуждения HRP:647 во время визуализации
Аргон 488 нм лазерЛасосДля возбуждения FM-красителя во время визуализации
МикрокузницаВПИМФ200Для огневой полировки стеклянных микропипеток
стимулятортраваС48Для управления светодиодной и электрической стимуляцией
Полностью транс сетчаткаМиллипора СигмаР2500Существенный кофактор для ChR2
Микроскоп Zeiss Stemi с портом для камерыЦейсс2000-СИспользуется во время стимуляции каналродопсина
Светодиод 470 нмТорЛабсМ470Л2Используется для активации ЧР
Светодиодный драйвер T-CubeТорЛабсСВЕТОДИОД1БДля управления светодиодом
Светодиодный блок питанияКомпания «Цинкон Электроникс»TR15RA150Для питания светодиода
Измеритель оптической мощности и энергииТорЛабсПМ100ДДля измерения интенсивности светодиодов
40-кратный объектив для погружения в воду AchroplanЦейссИспользуется во время электростимуляции и конфокальной визуализации
проекциях

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FM

Похожие статьи