1. Вскрытие личиночного клея
- Тщательно смешайте 10 частей основы из силиконового эластомера с 1 частью отвердителя силиконового эластомера из набора эластомеров (Таблица материалов).
- Покройте стекло 22 x 22 мм эластомером и отверждайте на горячей плите при температуре 75 °C в течение нескольких часов (до тех пор, пока он не перестанет быть липким на ощупь).
- Поместите одну стеклянную покровную крышку с эластомерным покрытием в специально изготовленную камеру для вскрытия плексигласа (Рисунок 1, внизу) для подготовки к вскрытию личинок.
- Приготовьте клеевые пипетки из капилляров из боросиликатного стекла с помощью стандартного съемника микроэлектродов для получения желаемой конусности и размера наконечника.
- Аккуратно отломите наконечник микропипетки и к другому концу прикрепите 2 фута гибкой пластиковой трубки (внутренний диаметр 1/32 дюйма, внутренний диаметр; внешний диаметр 3/32 дюйма, внешний диаметр; наружный диаметр 1/32 дюйма; стенка 1/32 дюйма; Таблица материалов) с ротовым штуцером (наконечник пипетки P2).
- Заполните небольшой контейнер (0,6 мл крышки пробирки Eppendorf) небольшим объемом (~20 мкл) клея (Таблица материалов) при подготовке к вскрытию личинок.
- Заполните камеру физиологическим раствором (в мМ): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 сахарозой и 5 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислотой (HEPES) pH 7,2.
- Добавьте антитело против пероксидазы хренской редьки (HRP), конъюгированное с Alexa Fluor 647 (анти-HRP:647; разведите 1:10 из 1 мг/мл) для мечения пресинаптического терминаля нервно-мышечного соединения (NMJ) во время диссекции.
- С помощью тонкой кисти (размер 2) извлеките блуждающую личинку третьего возраста из флакона с пищей и поместите ее на покровное стекло, покрытое эластомером.
- Заполните стеклянный наконечник микропипетки небольшим объемом клея с помощью отрицательного давления воздуха, создаваемого ртом с насадкой (шаг 1.5).
- Расположите личинку спинной стороной вверх щипцами и приклейте голову к покрытому эластомером покровному листу небольшой каплей клея с помощью положительного давления воздуха ртом.
- Повторите эту процедуру с задним концом личинки, следя за тем, чтобы животное было натянуто натянуто между двумя клеевыми креплениями.
- С помощью ножниц (лезвия 3 мм; Таблица материалов), сделайте горизонтальный разрез (~1 мм) сзади и вертикальный разрез по всей спинной средней линии.
- С помощью тонких щипцов (#5, Таблица материалов) аккуратно удалите тыльную сторону трахеи, кишечника, жирового тела и других внутренних органов, покрывающих мускулатуру.
- Повторите процедуру склеивания четырех створок стенки корпуса, аккуратно растягивая стенку корпуса как по горизонтали, так и по вертикали.
- Поднимите вентральный нервный канатик (ВНК) с помощью щипцов, аккуратно перережьте ножницами двигательные нервы, а затем полностью удалите ВНК.
- Замените диссекционный физиологический раствор на свободный от Ca2+ физиологический раствор (такой же, как и вышеуказанный диссекционный раствор без CaCl2), чтобы остановить цикл синаптических везикул (SV).
2. Визуализация: конфокальная микроскопия
- Используйте вертикальный конфокальный микроскоп с 40-кратным объективом для измерения флуоресценции красителя NMJ (можно использовать и другие микроскопы).
- Сфотографируйте мышцы 4 NMJ брюшных сегментов 2-4 (можно визуализировать и другие NMJ) и соберите изображения с помощью соответствующего программного обеспечения (Table of Materials).
- Используйте гелий-неоновый лазер 633 нм для возбуждения HRP:647 (с длинночастотным фильтром > 635 нм) и аргоновый лазер 488 нм для возбуждения FM1-43 (с полосовым фильтром 530-600 нм).
- Оперативное определение оптимального усиления и смещения для обоих каналов.
заметка: Эти настройки останутся неизменными на протяжении оставшейся части эксперимента.
- Проведите конфокальный Z-стек через всю выбранную NMJ от отмеченной HRP верхней и нижней части синаптической окончании.
- Внимательно обратите внимание на изображенный NMJ (сегмент, бок и мышца), чтобы убедиться в избытке точно такого же NMJ после выгрузки FM-красителя.
3. Загрузка красителя для стимуляции родродопсина FM
- Выращивать личинки, экспрессирующие ChR2, на пище, содержащей кофактор ChR2 all-trans-ретиналь (растворенный в этаноле; конечная концентрация 100 мкМ).
- Поместите личиночный препарат в камеру из оргстекла на предметный столик для препарирования микроскопа, оборудованный портом для камеры.
- Подключите синий светодиод (470 нм; Таблица материалов) к программируемому стимулятору с помощью коаксиального кабеля и поместите светодиод в порт камеры.
- Сфокусируйте синий светодиодный луч света на рассеченной личинке с помощью функции масштабирования микроскопа.
- Замените свободный от Ca2+ физиологический раствор в личиночном препарате физиологическим раствором выше FM1-43 (4 мкМ; 1 мМ CaCl2) на оптогенетической стадии.
- Установите параметры светодиода с помощью стимулятора (например, 15 В, частота 20 Гц, продолжительность 20 мс и время 5 минут (рис. 2)).
- Запустите световую стимуляцию и отслеживайте с помощью таймера заданную продолжительность периода оптогенетической стимуляции (например, 5 минут; Рисунок 2).
- Когда таймер остановится, быстро удалите раствор красителя FM и замените его на безсолевой раствор Ca2+, чтобы остановить цикл SV.
- Быстро промойте раствором Ca2+ (5 раз в течение 1 минуты), чтобы полностью удалить раствор красителя FM.
- Препарат для личинок следует хранить в свежем физиологическом растворе, не содержащем Ca2+, для немедленной визуализации с помощью конфокального микроскопа с использованием протокола визуализации.
- Внимательно запишите изображенный NMJ (сегмент, бок и мышца), чтобы обеспечить доступ к точно такому же NMJ после выгрузки FM-красителя.
4. Стимуляция каналродопсина: разгрузка FM-красителя
- Замените безсолевой раствор Ca2+ на обычный физиологический раствор (без красителя FM1-43) на предметном столике микроскопа с светодиодом порта камеры, направленным на личинку.
- Установите параметры стимулятора для разгрузки (например, 15 В, частота 20 Гц, длительность 20 мс и время 2 минуты (рис. 2).
- Запустите световую стимуляцию и отслеживайте с помощью таймера заданную продолжительность периода оптогенетической стимуляции (например, 2 минуты; Рисунок 2).
- Когда период таймера истечет, быстро удалите раствор красителя FM и замените его на безсолевой раствор Ca2+, чтобы остановить цикл SV.
- Быстро умойте раствором без Ca2+ (5 раз в течение 1 минуты), чтобы убедиться, что внешний краситель полностью удален.
- Препарат для личинок следует хранить в свежем физиологическом растворе без Ca2+ для немедленной визуализации с помощью конфокального микроскопа.
- Убедитесь, что вы визуализируете флуоресценцию красителя FM1-43 в том же NMJ, о котором говорилось выше, используя те же конфокальные настройки.
