Имплантация электрода в субталамическое ядро крысы

Аннотация

Источник: Fluri, F., et al., Имплантация электродов с микроэлектродами в субталамическое ядро крыс для долгосрочной глубокой стимуляции мозга. J. Vis. Exp. (2015)

Видео демонстрирует процедуру имплантации электрода в субталамическое ядро крысы для доставки электрических стимулов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Анестезия

1. Проверьте анестезиологическую систему, чтобы убедиться в достаточном поступлении газа (кислорода) и изофлурана на протяжении всей процедуры. Соедините носовой конус со стержнем резцов стереотаксического инструмента и установите планку резцов в положение -3,3 мм.
2. Включите подаваемый газ (2 л/мин). Поместите крысу в коробку и закройте крышку. Включите вапорайзер изофлурана на 3,5%.
3. Когда крыса находится в положении лежа, переключите систему так, чтобы анестезирующий газ поступал к носовому конусу, который закреплен на планке резца.
4. Извлеките крысу из камеры и сбрейте область между ушами и глазами; с помощью ватной палочки, смоченной в ПВП Йодосепт, промокните выбритую область, чтобы удалить выпавшие волосы.
5. Поместите крысу в носовой конус (рис. 1) и продолжайте анестезию изофлураном 2,5% в_О2 (1 л/мин). Проверьте уровень анестезии, защемляя межпальцевую область. Если крыса находится под адекватным обезболиванием, защитные рефлексы (т.е. отвод ноги) отменяются.
6. Контролируйте дыхание и реакцию на стимуляцию во время процедуры и при необходимости отрегулируйте вапорайзер.
7. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Система отопления с обратной связью контролирует и поддерживает температуру тела на уровне 37 ± 0,5 °C.

2. Хирургия

1. Сохраняйте операционное поле стерильным в течение всей операции. После того, как руки хирурга и операционное поле станут стерильными, двигайтесь только осторожно и не забывайте нарушать стерильность. Это включает в себя наличие стерильного поля (например, стерильных водонепроницаемых простыней), на которое можно положить инструменты.
2. Введите 0,2 мл мепивакаина подкожно в центр выбритой области. Мепивакаин – местный анестетик, который имеет продолжительность действия до 3 часов. Это еще больше обезболит операционную область.
3. С помощью скальпеля сделайте разрез по средней линии, начинающийся между ушами и простирающийся до 2 см. Убедитесь, что надкостница (блестящая мембрана под кожей) также надрезана. Обнажите череп четырьмя зажимами (Рисунок 2).
4. С помощью ватной палочки аккуратно удалите надкостницу до тех пор, пока не обнажатся корональные и сагиттальные швы, после чего остановите кровь ватой.
5. Определите координаты брегмы с помощью иглы, закрепленной на держателе щупа, а затем отметьте кончик иглы черным фломастером. С помощью передних/задних (AP), срединных/латеральных (ML) и дорсовентральных (DV) приводных винтов расположите кончик иглы непосредственно над брегмой.
6. Возьмите показания шкалы нониуса AP и ML: вычтите 3,6 мм из показаний AP и 2,5 мм из показаний ML для имплантации электродов в правый STN или прибавьте 2,5 мм для имплантации электродов в левый STN. Это положение будет отмечено красителем фломастера после опускания кончика иглы на поверхность черепа.
7. Зажмите бормашину на большом держателе щупа стереотаксического инструмента. Переместите бормашину на рассчитанную площадь – т.е. на отмеченную точку на черепе. Глядя в микроскоп, просверлите отверстие (диаметр около 1 мм) в черепе до тех пор, пока не станет видна твердая мозговая оболочка (толщина черепа около 1 мм). Втяните твердую мозговую оболочку с помощью микродиссекционных щипцов или стерильной иглы. Твердая мозговая оболочка достаточно прочная, чтобы разрушить кончик электрода.
8. Просверлите отверстие зубной бормашиной в каждой лобной чешуйке и в межтеменной чешуйке напротив отверстия электрода. Отсоедините держатель щупа от стереотаксического прибора. Не сверлите шов черепа, так как венозные сосуды следуют за швами под черепом.
9. Вкрутите костяной винт в каждое из пяти отверстий. Избегайте слишком глубокого закручивания винтов. Для винтов из нержавеющей стали (M1.6) 2–3 оборота винта будут адекватно удерживать винт, не оказывая давления на мозг. Количество оборотов будет зависеть от шага винта. Зажмите держатель щупа с электродом в микроманипуляторе (рисунок 3).
10. С помощью приводных винтов AP, ML и DV перемещайте держатель щупа вместе с электродом до тех пор, пока наконечник почти не коснется брегмы. Обратите внимание на показания шкалы нониусов AP, ML и DV на брегме. Когда показания будут сняты, поднимите электрод на несколько миллиметров, чтобы электрод не царапал череп во время движения. Чтобы определить координаты места, где электрод должен быть вставлен в отверстие, прибавьте 3,6 мм к показаниям AP и прибавьте (или вычтите) 2,5 мм к показаниям ML.
11. С помощью приводных винтов AP и ML переместите электрод в расчетное положение. В этот момент наконечник электрода должен располагаться непосредственно над просверленным отверстием для электрода. Затем, глядя в микроскоп, опустите электрод до уровня твердой мозговой оболочки (рисунок 4). Этот уровень служит нулевым уровнем в направлении DV. После этого аккуратно введите кончик электрода в мозг, глядя в микроскоп.
12. Подсоедините контакт электрода к разъему записывающей системы. Поместите клетку Фарадея (или замените ее алюминиевой фольгой) над крысой в стереотаксическом приборе (рис. 5). Заземлите стереотаксический инструмент с противовесом помещения, в котором ведется работа.
13. Запустите систему записи. Если это возможно, также используйте громкоговоритель для получения акустического сигнала разрядов/мазей отдельных единиц при продвижении электрода.
14. Медленно вводите электрод в мозг, записывая электрическую активность во время продвижения электрода. На глубине от 7,5 до 8,1 мм от твердой мозговой оболочки обычно обнаруживается удельная электрическая активность STN (рис. 6). Типичная активность нейронов в СТН характеризуется нерегулярным паттерном возбуждения и высокой частотой возбуждения (средняя частота: 40,9 ± 12,9 Гц).
15. Во время записи максимально уменьшите анестезию (например, до 0,8–1,0%); животные с низким уровнем анестезии демонстрируют более четкую электрическую активность мозга.
16. Смойте всю кровь или спинномозговую жидкость, которые были смещены с поверхности черепа при опускании электрода.
17. Смешайте небольшое количество стоматологического цемента и нанесите его вокруг электрода и вокруг четырех из пяти винтов с помощью небольшого шпателя (Рисунок 7). Пятый винт будет использоваться для фиксации заземляющего провода вилки.
18. Отсоедините штифт электрода от держателя электрода и подключите записывающую систему, когда стоматологический цемент будет зафиксирован.
19. Открутите винт, который не был зафиксирован стоматологическим цементом. Наденьте вилку на штифт электрода. Зафиксируйте провод заземления вилки пятым винтом (Рисунок 8).
20. Смешайте стоматологический цемент и нанесите его вокруг пробки. По мере загустения цемента сформируйте его вокруг пробки, чтобы получилась крышка. Избегайте острых краев зубного цемента, которые могут нанести вред животному, и удаляйте их во время затвердевания (Рисунок 9А и В).
21. Очистите края раны и закройте их швом спереди и сзади колпачка. Затем продезинфицируйте края раны.
22. Подсоедините вилку головки к проводу, который закреплен на вертлюге. Снимите крысу со стереотаксического инструмента.
23. Применяют трамадол (12,5 мг/кг, внутрибрюшинно) в конце вмешательства, а затем один раз в сутки в течение 2-3 дней. Поместите крысу в чистую клетку с термоподдержкой, закрепите вертлюг на этой клетке (рис. 10) и внимательно осмотрите ее в течение 1 часа.
24. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.

Результаты

Рисунок 1. Фиксация головы в стереотаксическом инструменте. Крыса фиксируется за ушные планки стереотаксической рамы, а также за маску для газовой анестезии.

>
Рисунок 2. Обнажение черепа. После разреза по средней линии кожа и надкос...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Pt/Ir электрод	FHC Inc.	УП	На заказ: Спецификация: UEPSEGSECN1M
Пробки	GT Labortechnik (Арнштайн/Германия)
Контактный разъем	ДИСТРЕЛЕЦ	Тел.: 143-95-324	однорядный, 90° 1x3, тип M80-8420342
розетка	ДИСТРЕЛЕЦ	Тел.: 143-95-621	однорядный, прямой столб 2 мм No1x3 датамат, тип M80-8400342
Пружина из нержавеющей стали	Пластики ONE	СС0102	Часть #: .120 x .156 Внутренний диаметр пружины (мм): 3.0 Наружный диаметр пружины (мм): 4.0
Стоматологический цемент/Паладур	Герей Кульцер	64707938	Жидкость, 500 мл
Стоматологический цемент/Паладур	Герей Кульцер	64707954	Пудра, роза, 500г
Винт с головкой	Хаммер и Рейсс	V2ADIN84 М1.6х3
Йодосепт ПВП	Ветохинол		435678/E04
Мепивакаин 1%	АстраЗенека		PZN03338515
адреналин	Санофи-Авентис		PZN00176118
Трамадолгидрохлорид	Ротексмедика		38449.00.00 (Английский)