$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка животного:
- Обезболивают крысу с помощью ингалянта (изофлурана) в дозе 1-2% доставляемого до эффекта или путем инъекции (кетамин, ксилазин, ацепромазин). Дозировка инъекционной анестезии следующая: 95,0 мг/кг кетамина, 10,0 мг/кг ксилазина, 0,075 мг/кг ацепромазина.
заметка: Мы успешно используем как ингаляционные, так и инъекционные анестетические подходы при проведении этого протокола записи CMAP, без каких-либо предпочтений.
- Животное должно находиться на соответствующей анестезиологической глубине до начала операции, до ее завершения и до тех пор, пока послеоперационный бупренорфин не начнет действовать. Подтвердите надлежащую анестезию кратким щипцом ноги, чтобы определить, что реакция отмены не вызвана. Дополнительно проверьте роговичный рефлекс с помощью ватного тампона. На протяжении всей хирургической процедуры определите, что частота сердечных сокращений и дыхания не увеличилась, что говорит о том, что глубина анестетика стала слишком легкой.
- Нанесите ветеринарную мазь на глаза животного, чтобы предотвратить сухость во время пребывания под анестезией.
- Перед началом операции хирург должен вымыть руки дезинфицирующим средством (скрабом с хлоргексидином). Хирург должен быть одет в стерильные перчатки, маску для лица, а также халат или чистый лабораторный халат. Перед операцией все инструменты должны быть вымыты и автоклавированы. Добавьте полоску индикатора стерилизации внутрь набора инструментов перед автоклавированием на уровне инструментов, чтобы убедиться, что стерилизация завершена. Перед началом операции хирург должен убедиться, что вся линия на полоске черная. Обмотайте коробку снаружи также указывающей автоклавной лентой. Если операция должна быть проведена нескольким животным в один и тот же день, очистите инструменты между операциями и стерилизуйте в стерилизаторе со стеклянными шариками. При необходимости стерилизуют оба конца инструмента в стерилизаторе со стеклянными шариками, поместив ручку инструмента в стерилизатор на соответствующее время, извлеките инструмент с помощью стерильного гемостата, охладите его в стерильном поле и затем поместите функциональный конец инструмента в стерилизатор стеклянных шариков на соответствующий срок.
- После того, как животное будет обезболито, поместите его на хирургическую доску тыльной поверхностью вниз и животом вверх, чтобы можно было использовать ленту для крепления передних конечностей животного к хирургической доске.
- Брейте вентральную поверхность каудально, начиная с основания черепа, и убедитесь, что область вокруг живота по обе стороны от средней линии выбрита, в зависимости от того, какая гемидиафрагма регистрируется. Нанесите повидон-йод на выбритую поверхность кожи.
2. Подготовка к записям CMAP:
- После подготовки животного поместите заземляющий электрод подкожно в хвост (Рисунок 1).
- Поместите электрод сравнения подкожно в контралатеральную нижнюю часть живота.
- Поместите проводящий гель на самоклеящуюся поверхностную полоску или дисковый записывающий электрод (размеры поверхностного полоскового электрода: 0,5 х 3 см), а затем поместите поверхностный электрод поперечно вдоль одностороннего реберного края.
- Стимулирующие электроды размещают чрескожно на расстоянии 0,5 см друг от друга латерально от трахеи и выше ключицы. Введите электроды примерно на 1,0 см вглубь кожи. Закрепите электроды рукой, чтобы их расположение не смещалось при последующих стимуляциях.
заметка: Электроды со стимулирующим углом 90° относительно кожи в месте введения.
3. Записи о потенциале действия сложных мышц (CMAP):
- Получение электрофизиологических записей с помощью стимулятора/усилителя с последующим компьютерным анализом данных.
- Параметры стимула при однократной тяговой стимуляции должны составлять 0,5 мс, 1,0 Гц сверхмаксимальные импульсы. Амплитуда стимула должна быть в диапазоне от 6,0 до 8,0 В (рис. 2A).
заметка: В рамках эксперимента используйте интенсивность стимула с одинаковой амплитудой у всех животных. Цель состоит в том, чтобы максимизировать амплитуду ответа за счет использования минимальной амплитуды стимуляции. Важно отметить, что первоначальная реакция, возникающая во время стимуляции, является артефактом стимуляции. Кроме того, следует позаботиться о получении ответа CMAP, которому предшествует стабильный/плоский исходный уровень после артефакта стимуляции, за которым затем следует быстрый ответ CMAP. Для получения такой реакции может потребоваться изменить положение электродов для стимуляции и/или записи.
- Подождите 30 секунд между стимуляциями и повторите 10 стимуляций подряд, чтобы получить средний ответ (рисунок 2B-C). Измерьте амплитуду от исходного уровня до пика (рисунок 2A). Проводите стимуляцию диафрагмального нерва во время фазы дыхательного цикла животного, когда диафрагмальный нерв/диафрагма не активированы. Процедуру можно повторить на том же животном для контралатеральной гемидиафрагмы.
- После заключительного сеанса записи CMAP перфузируйте животное, если будет проводиться окрашивание диафрагмального нервно-мышечного перехода (NMJ). Проводите запись CMAP на одном и том же животном повторно примерно один раз в неделю (или с интервалами по выбору).
- После записи CMAP для выживания позвольте животному восстановиться на циркуляционной грелке с теплой водой и непрерывно наблюдайте за происходящим во время восстановления до тех пор, пока оно не придет в себя и не ляжет. Не стоит возвращать животное, перенесшее операцию, в компанию других животных до полного выздоровления.
- После того, как животное будет лежаче, наблюдайте за ним каждые 12 часов в течение первых 48 часов (после этого один раз в день). Если животное выглядит обезвоженным (дряблая кожа, вялость), вводите жидкости (раствор лактата; подкожно; 1-2 мл на инъекцию, чередуя участки; 2 раза в день) до тех пор, пока послеоперационная потеря веса и жидкости не стабилизируются. В остром послеоперационном периоде в остром послеоперационном периоде животным дают размягченный корм в небольших посудах, при необходимости стимулировать прием пищи, если они не могут дотянуться до проволочной крышки кормушки.
- Вводите бупренорфин в дозе 0,05 мг/кг до окончания операции, а затем с интервалом в 12 часов в течение первых 24 часов (и в зависимости от признаков боли/стресса впоследствии) путем подкожной инъекции (поворачивая место). Если после этого будут замечены признаки боли или недомогания, обработайте животных бупренорфином. Признаки, указывающие на боль/дистресс, включают отсутствие активности, вокализации, недостаток еды или питья (обезвоживание), чрезмерную потерю веса, защиту, чрезмерное грызение или расчесывание в месте разреза. Дополнительные критерии, используемые при определении боли и дистресса, включают отсутствие реакции на посторонние раздражители, преходящую или неспровоцированную вокализацию, затрудненное или ненормальное дыхание, стойкие красновато-коричневые носоглазные выделения, выраженную пилоэрекцию. Также отслеживайте признаки плохой гигиены, которые могут указывать на больных животных. Если животное все еще находится в бедственном состоянии после 72 часов лечения (в соответствии с критериями боли/стресса, изложенными выше, и после получения протокола обезболивания, описанного выше), усыпьте животное.
