В естественных условиях Визуализация кальция с использованием синаптически локализованных кальциевых сенсоров у Drosophila melanogaster

Аннотация

Источник: Hancock, C. E. et al., In vivo оптическая кальциевая визуализация синаптической пластичности, вызванной обучением, у Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует метод визуализации кальция in vivo с использованием синаптически локализованных кальциевых сенсоров у мух. В нем описаны этапы подготовки мух к микроскопии, проведению обонятельного кондиционирования и визуализации притока кальция, вызванного запахом.

Протокол

1. Трансгенные плодовые мушки, Drosophila melanogaster

1. Скрещивайте самок девственных и самцов мух (выращенных при температуре 25 °C при относительной влажности 60% в течение 12-часового цикла свет/темнота), несущих желаемые конструкции Gal4 и UAS соответственно, чтобы получить мух, у которых специфические нейроны, представляющие интерес, экспрессируют генетически кодируемый индикатор кальция.
2. Возраст женского потомства вышеуказанного кросса до тех пор, пока он не окажется в диапазоне 3-6 дней после экклюзии. Самки мух предпочтительнее из-за их немного большего размера.

2. Подготовка плодовой мушки к визуализации кальция in vivo

1. Выберите одну самку мухи и обезболите ее на льду не дольше 5 минут.
2. С помощью тонких щипцов поместите муху в камеру визуализации (показано на рисунке 1в). Убедитесь, что грудная клетка и ноги находятся в контакте с электрическими проводами в нижней части камеры, а голова лежит ровно. Зафиксируйте положение мухи с помощью прозрачной клейкой ленты.
   заметка: Этот протокол требует специально сконструированной камеры, в которой мухи закреплены, а головная капсула доступна для открытия, и мухи могут получать как стимуляцию запаха антенн, так и удары электрическим током по грудной клетке и ногам (Рисунок 1).
3. С помощью лезвия хирургического скальпеля, закрепленного на рукоятке скальпеля (см. Таблицу материалов), прорежьте в ленте окно вокруг головы мухи, оставив усики закрытыми и обнажив только переднюю часть грудной клетки.
4. Окружите бока и затылок отверждающим клеем синего света, осторожно обработанным с помощью булавки от насекомых, удерживаемой вогнутыми выпуклыми челюстями. Закрепите клей с помощью синей светодиодной лампы, излучающей свет.
5. Убедитесь, что клей полностью схватился, и удалите остатки незатвердевшего клея со спинной поверхности головки мухи.
6. Нанесите каплю раствора Рингера (см. Таблицу материалов), чтобы покрыть обнаженную кутикулу головы.
7. С помощью ножа с очень тонким лезвием разрежьте кутикулу. Для наиболее эффективного удаления кутикулы сначала разрежьте заднюю часть головки, используя оцелли в качестве отправной точки. Затем разрежьте каждую сторону, медиально к глазам, чтобы сформировать лоскут кутикулы, который можно легко оторвать с помощью щипцов.
8. Удалите лишнюю кутикулу, которая может блокировать интересующую область мозга.
9. Осторожно очистите тыльную поверхность любой трахеи с помощью тонких щипцов, не допуская нарушения работы самой мозговой ткани. Удалите и обновите раствор Рингера (см. Таблицу материалов) по мере необходимости, чтобы очистить область от остатков ткани.
10. Поместите иглу для доставки подкожного запаха в положение примерно в 1 см от головы мухи. Убедитесь, что нет ничего, что могло бы помешать доставке запаха к антеннам.
11. В микроскопе подключите камеру визуализации к системе доставки запаха с помощью иглы для подкожных инъекций.
12. Чтобы позволить мухе полностью восстановиться после анестезии и хирургического вмешательства, а также адаптироваться к потоку воздуха, на этом этапе необходимо сделать 10-минутный период отдыха.

3. Визуализация кальция in vivo

1. Используйте многофотонный микроскоп, оснащенный инфракрасным лазером и водно-иммерсионным объективом (см. Таблицу материалов), установленный на виброизолированном столе. Для визуализации индикаторов кальция на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP) настройте лазер на длину волны возбуждения 920 нм и установите полосовой фильтр GFP.
2. С помощью ручки грубой регулировки по оси Z просканируйте ось Z мозга и найдите интересующую область мозга. Используйте функцию обрезки, чтобы сфокусировать сканирование только на этой области, чтобы свести к минимуму время сканирования и повернуть вид сканирования таким образом, чтобы передняя часть головы была обращена вниз.
3. Отрегулируйте размер кадра до 512 x 512 пикселей, скорость сканирования до > 4 Гц и область сканирования (в измерении Y) так, чтобы были охвачены интересующие нейроны.

4. Визуализация вызванных запахом переходных процессов кальция через обонятельное кондиционирование

1. Используйте систему доставки запаха, которая может доставлять несколько стимулов запаха с точностью до времени.
   1. Используйте дополнительный компьютер для управления устройством и для связи с программным обеспечением микроскопа для визуализации, чтобы координировать стимуляцию запаха с захватом изображения во время экспериментов.
   2. Инициируйте предварительно запрограммированный пакет макросов, способный связать программное обеспечение для получения изображений и программу доставки запаха (например, пакет макросов VBA, установленный в программном обеспечении для управления микроскопом, см. Таблицу материалов), который реагирует на внешний триггер ввода, обеспечиваемый инициацией протокола доставки запаха в отдельной программе).
2. Начните измерение с мониторинга «предтреночных»/наивных кальциевых переходных процессов, вызванных запахом, с разрешением 512 x 512 пикселей и частотой кадров 4 Гц. Подайте стимул запаха через 2,5 с с дополнительным получением изображения в течение 6,25 с до появления запаха (чтобы установить базовое значение F₀) и через 12,5 с после смещения запаха. Повторите то же самое со вторым одорантом, а затем с третьим одорантом.
3. Продолжайте через 3 минуты после этого измерения с классическим кондиционированием («дрессировкой») мухи.
   1. Выберите один из запахов, представленных на этапе «предварительной тренировки», чтобы он стал запахом условного стимула (CS⁺), а другой — запахом CS-. Подайте запах CS⁺ с помощью управляемой компьютером системы подачи запаха в течение 60 с одновременно с двенадцатью ударами током напряжением 90 В.
   2. После перерыва в 60 с используйте только запах CS-- в течение 60 с. Используйте в качестве одорантов 4-метилциклогексанол и 3-октанол. Не вводите третий одорант (например, 1-октен-3-ол) во время этой тренировки, так как он используется в качестве контроля только до (шаг 4.2) и после (шаг 4.4) фазы тренировки.
4. Снова измерьте «посттренировочные» переходные процессы кальция, вызванные запахом, повторив протокол стимуляции запаха «до тренировки» (шаг 4.2.) через 3 минуты после окончания фазы тренировки (шаг 4.3).
   заметка: Время выполнения этого шага должно отражать интересующее вас время после формирования памяти (например, выполните этот шаг через 3-4 минуты после этапа обусловливания для исследования кратковременной памяти). Как правило, мухи могут выживать в течение нескольких часов в этом препарате.
5. Сохраняйте файлы изображений в подходящем формате (например, Tiff) для последующего анализа изображений.

5. Анализ изображений

1. Чтобы проанализировать изображения, откройте файлы Tiff (или аналогичные) в программном обеспечении для анализа изображений, таком как Fiji.
2. Выровняйте стопки с помощью алгоритма коррекции движения, чтобы обеспечить минимальное смещение в направлениях X и Y. Отбросьте все записи, на которых видно сильное движение по оси Z.
3. Выберите программное средство, используемое для обозначения области интереса (ROI) вокруг исследуемой области. Это должно быть как можно точнее, чтобы ограничить влияние фоновой флуоресценции.
4. Используйте соответствующий программный инструмент для извлечения данных о временной интенсивности флуоресценции в виде файлов данных из выбранного ROI, чтобы значение создавалось для каждого кадра записи.
5. Откройте данные с помощью программы анализа данных, чтобы рассчитать значения ΔF/F₀ для каждой следа запаха. F₀ = средняя флуоресценция за 2 с до появления запаха. ΔF = разница между исходной флуоресценцией в данном кадре и F₀. Исходя из этих значений, вычислите значение ΔF/F₀ для каждого кадра, которое можно построить в зависимости от времени для отражения относительной флуоресценции в течение периода раздражения запахом.

Результаты

Рисунок 1: Строительство монтажной камеры и подготовка мухи к визуализации.а) Этапы изготовления монтажной камеры для мух. Основание выполнено из стандартного предметного стекла микроскопа (1), покрытого мелкой пластиковой сеткой (2). Два электрических провода, несущих противоположные заряды (3), приклеены к предметному стеклу с обеих сторон. Провода зачищаются и сгибаются так, чтобы...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1-октен-3-ол	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	О5284	Химическое вещество, используемое в качестве одоранта
3-октанол	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	218405	Химическое вещество, используемое в качестве одоранта
4-метилциклогексанол	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	153095	Химическое вещество, используемое в качестве одоранта
Полосовой фильтр для EGFP (525/50 нм)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Йена, Германия
Прозрачная клейкая лента	Tesa SE, Нордерштедт, Германия		Стандартная прозрачная клейкая лента
Вогнуто-выпуклые губки	Fine Science Tools, Северный Ванкувер, Канада	10053-09	Держатели лезвий с вогнутыми выпуклыми губками
Тонкие щипцы	Fine Science Tools, Северный Ванкувер, Канада	11412-11	Щипцы с наконечником 0,1 х 0,06 мм
Игла для подкожных инъекций	Sterican - Б. Браун, Мельзунгенк, Германия	4665120	1,20x40 мм
Булавки для насекомых	Fine Science Tools, Северный Ванкувер, Канада	26002-10	Диаметр 0,1 мм, наконечник 0,0125 мм
Кентофлоу	Kent Express Dental Supplies, Джиллингем, Великобритания	953683	Клей, отверждаемый синим светом
Предметное стекло микроскопа	Carl Roth GmbH & Co. KG, Карлсруэ, Германия	656,1	Стандартный объектив 76 x 26 мм
нефтепродукт	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	М8410	Используется в качестве разбавителя для одорантов
Лазер Ti-Sapphire Chameleon Vision 2 с синхронизацией мод	Coherent Inc., Санта-Клара, Калифорния, США		Настраиваемый инфракрасный фемтосекундный лазер
Многофотонный микроскоп LSM 7MP оснащен детекторами BiG	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Йена, Германия		Многофотонный микроскоп, несколько компаний предлагают аналогичные устройства.
Объектив для погружения в воду Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Йена, Германия	421452-9900-000	Объектив W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Решение Рингера	н.а.	н.а.	5 мМ KCl, 130 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 2 мМ CaCl2, 5 мМ Hepes-NaOH, 36 мМ сахароза, pH = 7,4
Колющий нож	Шарпоинт, Корпорация хирургических специальностей, Рединг, Пенсильвания, США	72-1551	5,0 мм Прямая ограниченная глубина лезвия
Лезвие хирургического скальпеля	Swann-Morton, Шеффилд, Великобритания	303	Товар No 11
Рукоятка хирургического скальпеля	Swann-Morton, Шеффилд, Великобритания	907	Товарный No 7S/S
Программное обеспечение Visual Basics of Applicatons (VBA) для приема триггера от устройства доставки запаха и устройство подачи электрошока (источник питания) для взаимодействия с программным обеспечением ZEN от Zeiss, которое управляет микроскопом.	Написан на заказ и доступен по запросу	н.а.	н.а.

Кабель гг.