Нейромодуляция, индуцированная ультразвуком с использованием системы микроэлектродных матриц

Abstract

Источник: Liang, R. et al., Сфокусированная ультразвуковая нейромодуляция нейронных культур человека in vitro в многолуночных микроэлектродных массивах. J. vis. Exp. (2024)

Это видео демонстрирует метод индуцирования модуляции нейронной активности в культивируемых нейронах, полученных из iPSC человека, в многолуночной микроэлектродной матрице или системе MEA с использованием сфокусированного ультразвукового преобразователя.

Protocol

1. Подготовка материалов

1. Аспирируйте питательную среду и используйте ее для заполнения одной лунки в 24-луночном культуральном планшете для нейронов со встроенной микроэлектродной матрицей (MEA) (рис. 1A).
2. Простерилизуйте интерфейс парапленки, резиновую ленту и конус сфокусированного ультразвука (FUS) с помощью резиновой мембраны с использованием 70% этанола в течение 10 минут и поместите их в вытяжной шкаф для последующей сборки.
3. Дегазируйте 300 мл деионизированной воды и 50 мл соединительного геля. Центрифугируйте воду и гель при 160 x g в течение 5 минут, чтобы избежать кавитации в соединительной среде.
   заметка: Первоначальным источником индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (HiPSCs) являются клеточные линии GM01582 и CIPS. В среднем может быть достигнута плотность 5 х 10⁴ моторных нейронов и 2,5 х 10⁴ астроцитов на лунку.

2. Подключение и настройка периферии

1. Закрепите конус FUS на датчике с помощью винтов и запечатайте конус гибкой резиновой мембраной в вентилируемом стерильном колпаке. Заполните конус дегазированной и деионизированной (DG-DI) водой, начиная с шага 1.3, и убедитесь в отсутствии пузырьков в конусе, чтобы избежать кавитации.
2. Используйте специальный резьбовой стержень, чтобы закрепить напечатанный на 3D-принтере держатель на раме (Рисунок 1B). Расположите раму таким образом, чтобы головка преобразователя FUS находилась над лункой, которая будет стимулироваться.
3. С помощью резиновой ленты закрепите парапленку над лункой на 24-луночной пластине MEA, содержащей среду и HiPSCs.
4. Подготовьте систему FUS, подключив внутреннюю электронику драйвера ультразвукового преобразователя, в данном случае выходную мощность преобразователя (TPO), к розетке 100–240 В и подключив согласующую сеть к TPO и преобразователю FUS. Согласующая сеть обеспечивает эффективную электрическую связь между датчиком и TPO.
5. Подключите систему MEA к розетке (100–240 В) (рис. 2B, подключение 5). Подключите порт синхронизации системы MEA к TPO (рис. 2B, подключение 3). Это соединение позволит синхронизировать сбор данных системой MEA с FUS стимуляцией.
6. Поместите 24-луночную пластину MEA в систему MEA и снимите крышку, чтобы обеспечить прямой контакт между датчиком и лункой. Поместите преобразователь на 5-10 мм выше луночной пластины, чтобы освободить место для дегазированного соединительного геля, как описано в шаге 3.2 (Рисунок 2A и Рисунок 1B).

3. Стимуляция и получение нейронных сигналов

1. Задайте параметры FUS на панели управления ТПО (таблица 1).
2. Нанесите соединительный гель поверх парапленки и опустите датчик FUS в соединительный гель, обеспечивая контакт с гелем с минимальным количеством пузырьков воздуха (рис. 1A).
3. Запустите запись системы MEA, нажав кнопку «Пуск» в пользовательском интерфейсе.
4. Запустите ультразвуковую терапию, нажав правую нижнюю кнопку на TPO (Рисунок 2A, Метка 7), и подождите не менее 5 минут между каждым раундом ультразвуковой обработки, чтобы позволить нейронам вернуться в исходное состояние.
5. Используйте импульс запуска, генерируемый системой FUS, для выравнивания последовательности стимуляции FUS с записью MEA (рис. 1B, соединение 3).

Таблица 1: Параметры сфокусированного ультразвука (FUS), установленные на TPO

параметр	ценность
Максимальная мощность/канал	1.200 Вт
Пактуальное	0,749 Вт/канал
ИСППА	10,79 Вт/см2
ИСПТА	0,05 Вт/см2
Длина пакета	0,100 мс
частота	250.00 кГц
фокус	39.800 мм
период	20 000 мс
таймер	60.000 с

Results

Рисунок 1: Нейромодуляция FUS с помощью многолуночной микроэлектродной матрицы (MEA). (A) Схема установки для нейромодуляции FUS с многолуночным MEA. Акустические волны, генерируемые преобразователем FUS, распространяются через конус FUS, заполненный дегазированной водой, и связываются с помощью ультразвукового геля. Парапленка крепится к колодцу с помощью резиновой ленты для предотв...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Система MEA	Аксион, Биосистема Инк.	Маэстро Эдж	Частота дискретизации: 11500 Гц
Пластина MEA	Аксион, Биосистема Инк.	CytoView MEA	Электрод и колодец: 16 электродов в 24 лунках
Интерфейс скважинной пластины	Компания «Амкор Инк.»	Парапленка PM996; П7793	Толщина: 127 μм
Бак и регулятор CO2 для культивирования	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296НЗ	Концентрация: 5%
Культурная среда	ThermoFisher Inc.	Ламинин; 23017-015	Концентрация: 1 мкг/мл
Нейроны HiPSC	Пепротех	CIPS и производные GM01582; 450-10	Концентрация: 10 нг/мл (см. Taga et al [2021]13)
датчик	Соник Концепс Инк.	СТХ250; 008	Центральная частота: 250 кГц
согласующая схема	Соник Концепс Инк.	СТХ250; НФС102в2	Импеданс: 50 Ω
Выходная мощность (TPO) преобразователя	Соник Концепс Инк.	Версия 4.1; 020	Частота: от 250 кГц до 2,5 МГц
мембрана	Макмастер Инк.	Силиконовый каучук; 5542N115	Толщина: 0,0127 см
Соединительный гель	Паркер Лаборатория Инк.	Аквасоник 100; B08DDWG GXB	Вязкость: 130 000–185 000 коп
Подключение к держателю щупа	Макмастер Инк.	Резьбовой стержень для кражи; 90322A661	Длина: 1–1/2 дюйма в длину
гидрофон	Соник Концепс Инк.	У-104; 009	Диапазон: 50 кГц–1,9 МГц
Резервуар для воды	Соник Концепс Инк.	ВТ	Размер: 30 см x 30 см x 30 см
Блок кондиционирования воды	Соник Концепс Инк.	УКУ; СН006	Скорость потока: 50 мл/с макс.
осциллоскоп	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	Частота дискретизации: до 50 МГц
сцена	Соник Концепс Инк.	МикроСтадия; 2	Точность: 1 μм
Термохромный лист	TIPTEMP Inc.	Жидкокристаллический лист; TLCSEN337	Диапазон: 22–24 °C
компьютер	Microsoft Surface	Surface Pro	Процессор i5 1035G4: 3,7 ГГц
Программное обеспечение для передачи данных	Mathworks Inc.	МАТЛАБ	Версия 2021b
Программное обеспечение для обработки	Python Software Foundation	питон	Версия 3.7.10