1. Настройка перед записью
- Приготовьте записывающие растворы с концентрациями ионов, как указано в таблице 1.
- Приготовьте 15 мл 2 М стоковых растворов в сверхчистой воде для MgCl2, CaCl2, KCl и CsCl.
- Твердые компоненты по 100 мл внутриклеточных и 500 мл внеклеточных буферных растворов в соответствии с таблицей 1 увесить в отдельные стаканы и после этого добавить соответствующее количество приготовленных исходных растворов. Например, для внутриклеточного буфера используйте 0,3803 г (10 мМ) EGTA (этиленгликоль тетрауксусная кислота), 0,2383 г (10 мМ) HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновая кислота) и 0,6428 г (110 мМ) NaCl и добавьте 100 мкл 2 М MgCl2 и CaCl2 и 50 мкл 2 М KCl и CsCl исходных растворов.
- Добавьте сверхчистую воду и тщательно отрегулируйте pH с помощью кислот и оснований, которые не мешают измерению, т.е. не проводятся ChR (Channelrhodopsins), такие как лимонная кислота и N-метил-D-глюкамин (NMG+).
- Отрегулируйте осмолярность до 290 мОм для внутриклеточных и до 320 мОм для внеклеточных растворов с глюкозой.
заметка: Слабогипоосмотические внутриклеточные растворы увеличивают вероятность успешности патчинга.
- Стерильно отфильтровать все растворы через фильтры размером 0,22 мкм. Хранить растворы при температуре 4 °C в течение двух недель или заморозить при -20 °C для длительного хранения.
- Расчет потенциалов перехода жидкости и подготовка протоколов записи.
Примечание: Изменение концентрации внеклеточного хлорида после установления конфигурации всей клетки приводит к значительному потенциалу жидкостного перехода (LJP), который необходимо скорректировать. LJP можно напрямую измерить или рассчитать, здесь используется последний вариант. В этом протоколе будет использоваться онлайн-коррекция, требующая одного протокола записи для каждого внешнего буфера. Однако для большего набора внешних решений рекомендуется проводить посткоррекцию LJP, чтобы избежать ложной коррекции.
- Откройте калькулятор потенциала перехода (JPC) и откройте диалоговое окно «Новый эксперимент». Затем выберите «Патч-зажимные измерения». Выберите «Измерения всего элемента» и «Стандартный электрод в солевом растворе» и введите температуру 25 °C. Между каждым шагом продвигайтесь вперед, принимая выбор, нажимая кнопку «Далее».
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводятся при комнатной температуре 25 °C в лаборатории с кондиционером. Перед началом экспериментов убедитесь, что буферные растворы имеют комнатную температуру. Для изменения температуры образца может использоваться инкубационная ступень или камера. Температуру в ванне часто можно измерять с помощью термометра.
- Добавьте все отдельные анионные и катионные концентрации пипетируемого раствора и буфера с высоким содержанием хлоридов в соответствии с концентрациями, указанными в таблице 1.
заметка: JPC рассчитает LJP в размере -0,5 мВ для начальных условий.
- Нажмите «Новый раствор для ванны», чтобы ввести анионный и катионный состав буфера с низким содержанием хлоридов.
заметка: Теперь JPC рассчитает новый LJP +12,6 мВ в соответствии с измененным решением для внеклеточной записи.
- Подготовьте два скорректированных по LJP протокола для двух условий измерения, вычитая рассчитанный LJP из приложенного потенциала удержания; -0,5 мВ для высокого и +12,6 мВ для наружных растворов с низким содержанием хлоридов. Таким образом, протоколы начинаются с -79,5 мВ (с высоким содержанием хлоридов) и -92,6 мВ (с низким содержанием хлоридов) соответственно, чтобы получить скорректированный по LJP пусковой потенциал удержания -80 мВ в обоих случаях.
заметка: Следующие шаги относятся к программному обеспечению для сбора данных, упомянутому в списке материалов.
- Откройте редактор протоколов в программном обеспечении для сбора данных. В меню «Режим» выберите «Эпизодическая стимуляция» и включите 7 разверток.
- Переключитесь в меню "Форма сигнала" в редакторе и включите период 200 мс с потенциалом удержания 0 мВ, за которым следует период 2 с переменным потенциалом удержания, начиная с -79,5 мВ для высокого содержания хлоридов. Включите «Дельта-уровень» 20 мВ для второго периода, чтобы увеличить потенциал удержания на 20 мВ в каждом развертии.
- В пределах шага напряжения редактора осциллограмм примените период 500 мс освещения светом 540 нм (3,10 мВт/мм²). Для этого измените "цифровую битовую диаграмму" подключенного затвора, который управляет источником света, на активную через 500 мс после второго периода, описанного выше (см. 1.2.6).
заметка: Интенсивность света может влиять на биофизические свойства токов канала, такие как амплитуда или инактивация. Поэтому всегда следует сообщать о плотности мощности света. Чтобы измерить мощность света после прохождения через всю оптику и покровное стекло, используйте откалиброванный оптометр. Чтобы рассчитать плотность мощности, определите освещенное поле объектива с помощью микрометра объекта и разделите измеренную мощность света на определенное освещенное поле.
- Приберегите протокол для внеклеточного раствора с высоким содержанием хлоридов. Измените протокол и замените потенциал удержания первого уровня на -92,6 мВ (низкий уровень внешнего хлорида). Сохраните этот второй протокол для измерения низкого содержания хлоридов во внеклеточном состоянии.
- Лизиновое покрытие стекол в соответствии с адаптированным протоколом.
- Поместите несколько 100 покровных листов в стеклянную чашку Петри и добавьте 250 мл HCl (1 N).
- Поставьте чашку Петри с крышкой на линейный шейкер. Встряхивайте при 120 об/мин в течение 72 часов, чтобы очистить покровные стекла, а затем промойте сверхчистой водой, чтобы нейтрализовать pH.
- Замочите их в небольшом объеме 95% этанола для дальнейшей очистки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чистые крышки можно хранить в 70% этаноле перед тем, как продолжить. Работайте под ламинарным колпаком для выполнения следующих шагов.
- С помощью горелки Бунзена и пинцета разожгите каждый покровный лист и переложите его в новую чашку Петри.
- Стеклянные покровные стекла инкубировать со стерильным раствором поли-D-лизина в концентрации 50 мкг/мл в течение не менее 1 ч (или в течение ночи) при комнатной температуре, одновременно встряхивая с помощью линейного шейкера при 150 об/мин.
- Промойте покровные стекла сверхчистой водой, чтобы удалить излишки поли-D-лизина.
- Разложите чехлы на стерильной бумаге для просушки в течение 10 минут и подвергните их воздействию ультрафиолетового излучения для стерилизации (не менее 20 минут).
- Соберите покровные листы в стерильную чашку Петри, покрытую алюминиевой фольгой, до использования.
- Получите ДНК гена PsACR1, слитого с mCherry, используя стандартные методы молекулярной биологии.
- Клонировать оптимизированную для кодонов человека последовательность генов, кодирующую PsACR1, в плазмиду peGFP-C1 (промотор ЦМВ (цитомегаловируса), резистентность к канамицину) в кадре с флуорофором mCherry с использованием ферментов рестрикции или других установленных методов клонирования><.
Примечание: Можно использовать и другие флуорофоры, но убедитесь, что у вас есть соответствующие наборы фильтров для наблюдения за их флуоресценцией под микроскопом.
- Трансформируйте плазмидную ДНК в хемокомпетентные клетки XL1Blue E. coli с помощью теплового шока в соответствии со стандартным протоколом и поместите их на агаровые пластины (30 мкг/мл канамицина). Вырастите покрытые бактерии в течение ночи при температуре 37 °C.
- На следующий день инокулируют 4 мл лизогенной бульонной среды с добавлением 30 мкг/мл канамицина в клетки одиночных колоний и инкубируют их в течение ночи при 37 °C и 180 об/мин в инкубаторе.
- После ночной инкубации очистите плазмидную ДНК от культур с помощью имеющегося в продаже набора в соответствии с инструкцией производителя.
- Засейте клетки
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте действия под колпаком с ламинарным потоком.
- Поместите до трех стеклянных покровных стекол с лизиновым покрытием рядом в чашку Петри диаметром 35 мм.
заметка: Аккуратно прижмите их к дну посуды, чтобы не соскользнуть друг на друга.
- Семена 1,5 x 105 HEK (человеческие эмбриональные клетки почек) в 2 мл стандартной модифицированной орлиной среды Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS) в каждой чашке.
- Добавьте полностью транс-ретиналь в конечной концентрации 1 мкМ. Выращивайте клетки в течение как минимум одного дня, прежде чем приступать к этапу 1.6.
- Временно трансфектируйте клетки с помощью липофектии.
- Для каждой чашки клеток приготовьте раствор из 2 мкг плазмидной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) в 250 мкл DMEM без FBS и 6 мкл трансфекционного реагента.
- После 15 мин инкубации аккуратно (по каплям) добавить раствор в клетки.
- Подготовьте мостики из агара
- Добавьте 0,75 г агарозы в 50 мл стерильного раствора хлорида натрия (140 мМ) и растворите его путем нагревания в микроволновой печи><.
ПРИМЕЧАНИЕ: 2 - 3 М KCl для приготовления агарового мостика еще больше снижает LJP из-за более высокой концентрации (например, постоянной диффузии от мостика) и равной подвижности ионов K+ и Cl-, но этого не удалось избежать, чтобы свести к минимуму утечку ионов (особенно Cl-) в раствор ванны.
- Наполните наконечники пипеток объемом 10 μл (или шланг малого диаметра) жидким раствором агарозы с помощью шприца.
заметка: Избегайте попадания пузырьков воздуха в мостик.
- После того как агаровые мостики остынут и затвердеют, храните их в стерильном растворе хлорида натрия с концентрацией 140 мМ.
- Подготовьте записывающие электроды и электроды для ванны.
- Извлеките серебряные провода из ванны и записывающий электрод установки патч-хомута.
- Отполируйте провода наждачной бумагой, чтобы удалить хлорид серебра из предыдущих экспериментов. Погрузите чистый серебряный провод в 3 М KCl и подключите его к положительному полюсу аккумулятора 1,5 В для электролитического покрытия хлоридом серебра><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо батареи можно использовать лабораторный источник питания.
- Извлеките патч-пипетки с низким сопротивлением (1,5-3,0 МОм) из стеклянных капилляров с помощью съемника микропипеток и отполируйте их огнем. Храните пипетки без пыли в день измерения.
- Включите все компоненты настройки для нагрева до рабочей температуры за 30 минут до записи. Убедитесь, что буферы имеют комнатную температуру.
2. Измерения селективности
- Начните запись через 24-48 ч после транзиторной трансфекции клеток.
- Поместите одну крышку в измерительную камеру и загерметизируйте ее силиконом, чтобы предотвратить утечку внешнего буфера. Храните чашку Петри вместе с другими покровными стеклами в инкубаторе для следующей серии экспериментов.
- Осторожно заполните камеру внеклеточным буфером (с высоким уровнем [Cl-]), чтобы предотвратить отслоение клеток, затем поместите его под микроскоп и используйте объектив 40X для визуализации клеток.
- Наденьте агаровый мост на электрод ванны и поместите его в камеру вместе с датчиком уровня жидкости и выходом перфузии манипулятора для ванны.
- Дважды замените внеклеточный раствор 1 мл свежего наружного раствора (с высоким содержанием [Cl-]) для удаления остаточной питательной среды и отделенных клеток.
- Соберите клетки в фокус и найдите трансфицированную (флуоресцентную) клетку, которую нужно выделить из других клеток. Используйте трехполосный фильтр и оранжевый свет (590 нм; ширина полосы 15 нм; интенсивность 100%) для возбуждения и визуализации mCherry.
заметка: Элементы HEK могут быть электрически связаны со своими соседями с помощью щелевых переходов, что приводит к низкому сопротивлению мембраны в конфигурации с целыми ячейками.
- Наполните одну из вытянутых пипеток внутриклеточным раствором и удалите пузырьки воздуха, несколько раз перевернув пипетку.
- Установите пипетку на держатель пипетки и надавите на нее, чтобы предотвратить засорение наконечника.
- Найдите кончик патч-пипетки под микроскопом и переместите его близко к клетке с помощью микроманипулятора.
заметка: Следующие шаги относятся к усилителю, программному обеспечению для сбора и оценки данных, упомянутому в перечне материалов.
- Запустите «тест мембраны» в программном обеспечении для сбора данных и подайте шаг напряжения (тестовый импульс; например, 5 мВ в течение 10 мс, базовый уровень при 0 мВ), вручную или автоматически через указанное программное обеспечение с использованием «режима ванны» во время выполнения «теста мембраны» в программном обеспечении для сбора данных.
- Убедитесь, что сопротивление пипетки находится в нужном диапазоне (1,5-3,0 МОм).
- Обнуление токов смещения путем регулировки потенциала пипетки поворотом ручки смещения пипетки на усилителе во время работы в «режиме ванны» «мембранного теста».
- Установите патч в конфигурацию целой ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги требуют приложения положительного и отрицательного давления, подаваемого на боковой порт используемого держателя для пипетки. Это можно сделать с помощью шприца, мундштука или регулятора давления с электронным управлением. В этом протоколе положительное и отрицательное давление подается через мундштук.
- Медленно подойдите к ячейке с помощью патч-пипетки сверху и сбросьте положительное давление прямо перед тем, как прикоснуться к ней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда кончик находится близко к ячейке, сопротивление немного возрастет; На это указывает уменьшенный размер тестового импульса.
- Измените «мембранный тест» с «режима ванны» на «режим патча», тем самым увеличив потенциал удержания к ожидаемому потенциалу покоя клеток (от -30 до -40 мВ).
- В некоторых случаях конфигурация, прикрепленная к элементу, формируется сама по себе после сброса положительного давления. Если нет, осторожно приложите отрицательное давление, чтобы помочь образованию гигауплотнения.
заметка: Конфигурация, присоединенная к ячейке, устанавливается, когда испытательный импульс уменьшается до двух небольших емкостных пиков в начале и конце импульса, а сопротивление мембраны находится в диапазоне GOM; Отрицательное напряжение до -60 мВ может способствовать образованию гигауплотнений.
- Компенсируйте емкость пипетки, поворачивая ручки «Компенсация емкости пипетки», чтобы получить плоский отклик тестового импульса.
- Разорвите пластырь, не разрушая уплотнение, применяя короткие импульсы отрицательного давления или отрицательного давления с возрастающей силой, чтобы получить цельноклеточную конформацию.
заметка: Об успешном переходе от присоединенной к цельнояческой конфигурации свидетельствует увеличение емкостных пиков.
- Применяйте компенсацию последовательного сопротивления путем установки параметров всей ячейки и регулировки компенсации используемого усилителя для точного зажима мембранного потенциала до желаемого удерживаемого напряжения.
- Переключите «тест мембраны» в режим «цельная ячейка», на панели «Компенсация последовательного сопротивления» включите «прогнозирование» и «коррекцию» до 90% избегая перебоев и колебаний емкостной характеристики, включите переключатель компенсации всей ячейки и отрегулируйте параметры всей ячейки с помощью соответствующих ручек передней панели («емкость всей ячейки» и «последовательное сопротивление») усилителя итеративным образом для получения идеальной Реакция плоского испытательного уплотнения.
заметка: Подробное описание компенсации и коррекции последовательного сопротивления см. в руководстве или руководстве по усилителю, поскольку эта процедура различается у разных производителей.
- После создания конфигурации всей клетки подождите не менее 2 минут перед записью, чтобы обеспечить достаточную замену внутриклеточного раствора через патч-пипетку.
- Регистрация световых индуцированных токов при различных удерживающих потенциалах с использованием протоколов, которые были настроены ранее (в 1.2).
- Замените внеклеточный буфер на низкое [Cl-] в камере не менее пяти раз, не разрушая пластырь, и запишите еще одно отношение ток-напряжение (см. шаг 1.2) при новой концентрации хлорида.
заметка: Перфузионная система для автоматического буферного обмена облегчает этот процесс, но не является обязательной.
- Повторите 2.15. для каждого ионного состояния, которое необходимо проверить, но повторно проверьте качество участка между измерениями с помощью «мембранного теста», описанного выше><.
заметка: Чтобы гарантировать точное напряжение мембраны и стабильный внутриклеточный ионный состав, сопротивление мембраны должно быть выше 500 МОм, тогда как сопротивление доступа не должно превышать 10 МОм (см. 2.12.6). Не забудьте отключить компенсацию параметров всей клетки для проведения мембранного теста.
- Повторите действия с пунктов 2.2 по 2.15 для нескольких клеток, но для обеспечения здоровья клеток возьмите новый покровный листок.
Таблица 1: Ионный состав буферизованных растворов. Состав внутриклеточных (внутри) и внеклеточных (экстра.) буферов для экспериментов по селективности хлоридов в клетках HEK. Используемые сокращения: этиленгликоль, тетрауксусная кислота (EGTA), 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновая кислота (HEPES) и аспартат (ASP). Все концентрации указаны в мМ.
См.
См.
См.
| интра. | экстра.1 | экстра.2 |
| Высокое содержание хлоридов | Низкое содержание хлоридов | Низкое содержание хлоридов |
| c [мМ] | c [мМ] | c [мМ] |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl2 | 2 | 2 | 2 |
| ХЕПЕС | 10 | 10 | 10 |
| ЭГТА | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| Осмолярность | 290 мОсм | 320 мОсм | 320 мОсм |
