Перфорированные патч-зажимы для записи тел сенсорных нейронов внутреннего уха

Аннотация

Источник: Iyer, M. R., et al. Выделение и культивирование вестибулярных и спиральных ганглиозных сомат у неонатальных грызунов для записей с помощью патч-зажима. J. Vis. Exp. (2023).

Это видео демонстрирует технику патч-хомута для измерения ионных токов в телах сенсорных нейронов внутреннего уха. В нем подробно описывается приготовление и использование полированной пипетки с патч-хомпом, заполненной внутренним раствором, содержащим амфотерицин В, который перфорирует мембрану, обеспечивая движение ионов при сохранении внутриклеточных условий. Импульсы напряжения подаются для запуска и регистрации активности ионных каналов, что дает представление об их свойствах и поведении.

Протокол

1. Запись

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой процедуре записи патч-клэмпа из изолированного ганглия обычно выполняются через 12-24 часа после нанесения покрытия. Другие лаборатории сообщили о результатах исследования нейронов после гораздо более длительных периодов культивирования.

1. Подготовьте камеру записи
   1. Используйте камеру для быстрой замены записи (или аналогичную), которая позволяет записывать с помощью патч-зажима непосредственно в чашке для культуры. Установите камеру на инвертированный микроскоп.
   2. Вставьте в камеру посуду со стеклянным дном.
   3. Подайте раствор L-15 через систему перфузионных трубок в записывающую камеру. Стабилизируют перфузионный приток и отток в камере со скоростью 0,5-1 мл в минуту.
2. Приготовьте внутренний раствор для нагрузки электродов
   1. Разморозьте аликвоту перфорированного внутреннего раствора. Нанесите 2,5 мл раствора на чашку для культуры диаметром 35 мм. Закройте крышку на чашке для культуры и наклейте на нее этикетку с надписью «Tip Dip». Отставьте в сторону в свободной от пыли зоне, так как очень важно содержать это решение в максимально чистой форме.
   2. Взвесьте 1 мг амфотерицина-В и добавьте 20 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Сделайте вихрь и раскрутите раствор до тех пор, пока весь амфотерицин-B не окажется в растворе. Добавьте 10 мкл раствора ДМСО/амфотерицина-B к оставшимся 2 мл размороженного внутреннего раствора перфорированного пластыря. Извлеките и рассейте раствор с помощью пипетки два или три раза, чтобы убедиться, что ДМСО/амфотерицин-B равномерно смешался с внутренним раствором. Раствор будет иметь слабо-желтоватый оттенок.
   3. Наберите внутренний раствор перфорированного пластыря амфотерицина-В в шприц объемом 3 мл. Добавьте в шприц наконечник массой 34 г. Оберните шприц алюминиевой фольгой и держите шприц на льду.
      заметка: Этот раствор необходимо переделывать каждые 2 ч, чтобы обеспечить эффективность амфотерицина-В в перфорации клеточной мембраны. Амфотерицин-В чувствителен к свету, и его необходимо экранировать от света с помощью алюминиевой фольги или других методов.
3. Патч-клэмпинг записи
   1. Визуализируйте нейроны с помощью объектива 10x или 20x. Отрегулируйте освещение и оптимизируйте оптику, чтобы увидеть границы и тени вокруг ячейки.
   2. Проверьте качество выделенных нейронов. Пытайтесь использовать нейроны только с гладкими и ровными поверхностями, которые не слишком сильно контрастируют и имеют лишь небольшие, рассеянные кратеры. Кроме того, избегайте пар нейронов, нейронов, окруженных мусором, или других клеток.
   3. При 100-кратном увеличении определите нейрон или поле нейронов для коммутации и выровняйте их в центре поля зрения.
   4. Заполните кончик пипетки чистым раствором, не содержащим амфотерицина, опустив наконечник (на ~20 с) в чистый раствор, который был помещен в чашку для культивирования. Капиллярное действие втянет небольшое количество раствора в ><наконечник. заметка: Выполните этот шаг под стереодиссекционным микроскопом, который позволяет определить, насколько хорошо наконечник удерживает раствор Tip Dip. Если раствор не держится в течение ~10-20 с, форма электрода не идеальна. В этом случае перенастройте программу вытягивания электродов, чтобы получить более длинный наконечник.
   5. Далее заполните заднюю часть пипетки внутренним раствором, содержащим амфотерицин. Нить внутри пипетки будет втягивать раствор вниз, чтобы встретиться с чистым раствором в наконечнике. Позвольте нити плавно вытянуть раствор вниз и не пытайтесь выдавливать пузырьки, так как это приведет к слишком быстрому попаданию амфотерицина на кончик.
   6. С помощью шприца вытяните раствор, который может находиться в самой задней части электрода.
      заметка: Очень важно быстро работать от этой точки до приземления и формирования высокопрочного уплотнения на нужной ячейке.
   7. Вставьте пипетку в держатель пипетки. Убедитесь, что пипетка плотно прилегает к держателю, чтобы предотвратить смещение пипетки. Если пипетка неустойчива, замените уплотнительные уплотнительные кольца спереди и сзади держателя пипетки, чтобы свести к минимуму дрейф и поддерживать сильное всасывание. Замените пипетку на только что заполненную.
   8. Опустите пипетку в ванну записывающей камеры.
   9. Расположите наконечник пипетки в центре поля зрения. Убедитесь, что на наконечнике нет пузырьков воздуха или другого мусора.
   10. Примените шаг напряжения (5 мВ) в испытании мембраны, чтобы контролировать сопротивление пипетки. Продолжайте контролировать входное сопротивление на протяжении всего процесса формирования уплотнения на элементе.
   11. Отмените потенциал смещения пипетки таким образом, чтобы ток пипетки показывал ноль в режиме проверки мембраны pClamp.
   12. Откорректируйте емкость пипетки с помощью функции быстрой компенсации емкости на усилителе с патч-клемтом (быстрые диски Cp в программной панели Multiclamp Commander).
   13. Переместите пипетку вниз к ячейке.
   14. Когда пипетка окажется достаточно близко к нейрону, переключитесь на объектив с большим увеличением и отправьте изображение через камеру на монитор (используйте объектив с 40-кратным увеличением, общее увеличение 400-кратное). Отрегулируйте пипетку и снова центрируйте нейрон.
   15. Переместите записывающий электрод близко к соме. Найдите центр нейрона на мониторе и расположите записывающий электрод над нейроном.
   16. Подойдите к нейрону сверху, таким образом, чтобы электрод оказался в центре сферической ячейки. Отрегулируйте смещение пипетки до нуля постоянных потенциалов постоянного тока в системе.
   17. Расположите пипетку близко к мембране. Плотно приземлитесь на центр ячейки.
       заметка: При приземлении произойдет небольшое углубление на поверхности нейрона и удвоение/утроение входного сопротивления.
   18. Надавите отрицательно (отсосите) с помощью шприца или ротовой пипетки. Включите удерживающий потенциал -60 мВ. Сопротивление уплотнения должно увеличиваться до тех пор, пока оно не пройдет гигаом.<бр /> заметка: Работайте быстро, чтобы сократить время между заполнением электрода и посадкой на элемент. Существует ограниченное время, прежде чем амфотерицин, добавленный во внутренний раствор перфорированного пластыря, достигнет кончика электрода. После того, как наконечник загрязнен амфотерицином, трудно сформировать высокопрочные уплотнения, и сопротивление часто останавливается до ~200 мегаом.
   19. Как только образуется гигаомное уплотнение, сбросьте отрицательное давление. Как только уплотнение сформируется, примените быструю компенсацию емкости, чтобы максимально снизить амплитуду переходных процессов емкости пипетки в режиме испытания мембраны.
   20. Когда амфотерицин начинает действовать, наблюдайте, как входное сопротивление медленно уменьшается, а ток, протекающий в ответ на шаг напряжения 5 мВ, постепенно увеличивается по мере того, как амфотерицин проникает в мембрану. Внезапное снижение последовательного сопротивления вместо постепенной стабилизации говорит о том, что произошел спонтанный разрыв.
   21. Оцените емкость всей ячейки и последовательное сопротивление с помощью функции обнуления емкостных переходных процессов усилителя. Документируйте и контролируйте последовательное сопротивление в начале и регулярно во время эксперимента><. заметка: Для стабилизации последовательного сопротивления может потребоваться от 5 до 20 минут, в зависимости от размера электрода и количества чистого раствора, втягиваемого в пипетку. Режимы «Напряжение-зажим» и «Ток-токо-клещи» могут использоваться, когда последовательное сопротивление стабилизируется ниже 30 мегаОм. Иногда наблюдается набухание или сжатие нейронов во время записи, но редко при правильной корректировке осмолярности и рН растворов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Амфотерицин	Сигма-Олдрич	А4888-100МГ	Для записи перфорированных патчей.
АТФ ди-натрия	Сигма-Олдрич	А7699	Добавка к внутреннему раствору
CaCl2	Джей Ти Бейкер	1311-01	Добавка к внутреннему раствору
Дмсо	Биотиум	90082
ЭГТА	Сигма-Олдрич	Е0396	Добавка к внутреннему раствору
Съемник электродов	Нарасигэ	ПК-10
этанол	Лаборатории Decon	2716	для чистки головки и стола для вскрытия
Филаментированные боросиликатные капилляры для электродов	Инструменты Саттера	БФ140-117-10
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич	Х3375-100Г	для буферизации pH все растворы в протоколе
Нагревательные плиты / магнитные мешалки	ВВР	76549-914 (Английский)
K2SO4, сульфат калия	Сигма Олдрич	П9458-250Г	Добавка к внутреннему раствору
KCl	Сигма-Олдрич	П93333	Добавка к внутреннему раствору
КОН (1 М)	Ханивелл	319376-500МЛ	Довести внутренний раствор до желаемого pH.
Низкопрофильная ванна для записи посуды для культур	Уорнер Инструментс	64-0236 (Английский
MgCl 2-гексагидрат	Сигма-Олдрич	М1028	Добавка к внутреннему раствору
Игла microFil для наполнения микропипеток - 34 калибр	Мировые прецизионные приборы	MF34G
Микрокузница	Нарасигэ	МФ-90	Для полировки электродов.
NaCl	Сигма-Олдрич	С7653	Добавка к внутреннему раствору
NaOH (1 М)	Томас Сайенти	319511-500МЛ	для титрования pH
Кислород, медицинский класс, с соответствующим регулятором и трубкой	Управление материальными ресурсами ОСК	MEDOX200 (Идентификатор: 00015)	для растворения в диссекционных растворах и ваннах
Стекло с поли-d-лизиновым покрытием<бр /> Блюдо из культуры	Маттек	П35ГК-0-10-К	к пластинчатым нейронам для культивирования
Мембранные фильтры PES, 0,2 микрометра	Налген	566-0020	для фильтрующих решений
Мембранные стерильные шприцевые фильтры PES, 0,22 мкм, 30 мм	КЛЕТОЧНЫЙ ТРАКТ	229747	для фильтрации растворов, набираемых в шприцы
pH-метр	Mettler Toledo	Модель S20
Опорная ячейка	Мировые прецизионные приборы	РК1Т
Научный масштаб	Mettler Toledo	ХС64
Мерная колба, 1000 миллилитров
Вода, стерильная u ltrapure, R>18,18 мегаОм см (например, отфильтрованная системой очистки воды Millipore-Sigma)	Миллипор-Сигма	CDUFBI001