Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка электродов (Рисунок 1A-C)
ПРИМЕЧАНИЕ: Локусы контактов компьютера - это просто контакт с зубцами как часть сигнального интерфейса в устройствах связи. Он состоит из штекерного разъема, который вставляется в гнездовой разъем.
- Осторожно отделите штыревые и гнездовые контакты от мест контактов компьютера (рис. 1A) с помощью клещей. Соедините штыри с наружной и внутренней резьбой вместе, чтобы сформировать электрод, и нанесите цианоакрилат для создания прочного адгезивного соединения (Рисунок 1C).
- Поместите электроды в стакан, наполненный дистиллированной водой, и поместите его в ультразвуковой очиститель на 10 минут. Переместите их в сушильную печь при температуре 45 °C на 30 минут. Простерилизуйте электроды с помощью ультрафиолетового (УФ) света в течение 30 минут.
2. Хирургическая процедура (Рисунок 1D-F)
- Подготовьте стерилизованные хирургические инструменты и стереотаксические аппараты. Обезболить новорожденного крысы-детеныша с помощью изофлурановой анестезии (2,5 %) воздухом. Когда щенок глубоко обезболит, отрегулируйте дозу изофлурана до 1,0%. Перед операцией выполните ущипывание хвоста или пальца ноги, чтобы обеспечить надлежащую глубину анестезии.
- Зафиксируйте голову щенка в стереотаксическом аппарате, поместив ушные планки в ушные каналы и слегка затянув их.
заметка: Не стоит чрезмерно затягивать ушные планки, так как неонатальный череп очень мягкий.
- Поддерживайте стерильность операционного поля, распыляя на все оборудование 70% этанола. Сделайте 15-миллиметровый разрез на голове с помощью скальпеля. С помощью щипцов аккуратно оттяните кожу головы от средней линии по четырем углам. Положите под кожу немного ваты, смоченной в физрастворе, чтобы разрез оставался широко открытым (рисунок 1D).
- Найдите точки брегмы и лямбды на черепе и отметьте их карандашом. С помощью иглы шприца (26 G) проделайте два отверстия для заусенцев в префронтальной коре (ПФК) и гиппокампе.
заметка: ПФК расположена на расстоянии +1,8 мм позади брегмы и на -0,5 мм латерально от средней линии, в то время как гиппокамп расположен на расстоянии -2,0 мм перед брегмой и ±0,5 мм латерально от средней линии (рис. 1D и E). Глубина электрода не должна быть более чем на 2 мм ниже поверхности коры головного мозга, чтобы свести к минимуму повреждение мозга.
- С помощью щипцов удерживайте электроды и вставьте референтный и записывающий электроды в ПФК и гиппокамп соответственно. Нанесите эритромициновую мазь вокруг электрода, чтобы избежать любой возможной инфекции. Зафиксируйте электрод с помощью цианоакрилата.
- Приготовьте стоматологический акриловый цемент так, чтобы он имел клейкую и вязкую консистенцию. Нанесите стоматологический цемент, чтобы покрыть электроды и остальную часть черепа><.
заметка: Тщательно просушите череп перед нанесением стоматологического цемента.
- Нанесите 5% пикриновую кислоту на электроды, чтобы защитить их.
заметка: Вся процедура должна проводиться в капюшоне с биологической безопасностью для поддержания стерильных условий.
- Извлеките животное из стереотаксической рамки и введите подкожно 300 мкл 10% глюкозы. Положите его на подогреваемое одеяло для восстановления. Убедитесь, что животное находится в тепле (37 °C) и передвигается (т.е. полностью выздоровело). Введение бупренорфина внутрибрюшинно (0,05 мг/кг) при послеоперационной боли.
заметка: Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание (т.е. к нормальному поведению и движениям).
- Верните щенка в его домашнюю клетку вместе с матерью после того, как он придет в сознание. Подождите двое суток, пока животное полностью не выздоровеет.
3. Запись ЭЭГ
- После полного выздоровления подключите имплантированные на череп щенка электроды к усилителю в его собственной клетке. Подключите усилитель к аналого-цифровому преобразователю и подключите преобразователь к компьютеру; К соединительным линиям следует относиться бережно, чтобы они не запутались.
- Выберите частоту дискретизации не менее 10 000 Гц на блоке сбора данных для записи (ширина полосы пропускания передатчика составляет 1-100 Гц). Убедитесь, что выборка данных выполнена правильно.
- После получения исходной записи внутрибрюшинно введите детенышу каиновую кислоту (КА, 2 мг/кг) для индуцирования эпилептических припадков. Через 15 минут после инъекции КА наблюдайте и записывайте эпилептические разряды. Приступы, возникающие через КА, обычно носят физический характер><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность иктально-тонической терапии составляет около 15,2 ±0,9 с, продолжительность судорог около 62±5 с. Судороги у новорожденных крыс можно предотвратить, вводя впрыск хлоралгидрата (400 мг/кг).
- Сохраните оцифрованные данные и проанализируйте их с помощью программных пакетов обработки сигналов, таких как spike2. Определите уровень мощности различных частотных составляющих в неонатальном сигнале ЭЭГ с помощью анализа спектра мощности. Рассчитайте мощность за 1 минуту, найдя среднеквадратичную амплитуду от 1 до 100 Гц (диапазон ЭЭГ).
