Запись нейронных связей в острых срезах мозга с помощью парного пластыря

Аннотация

Источник: Qi, G., et al. Электрофизиологическая и морфологическая характеристика нейронных микросхем в острых срезах мозга с использованием парных записей патч-зажима. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует процедуру картирования синаптических связей путем закрепления среза мозга, позиционирования пипеток для достижения конфигураций целых клеток и стимуляции пресинаптических нейронов для записи постсинаптических реакций, тем самым проясняя нейронные связи.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Запись парного патч-зажима и заполнение биоцитина

В зависимости от типа синаптической связи, используются три различных подхода для поиска синаптически связанных нейронов. Если вероятность соединения мала (как можно ожидать для большинства возбуждающих связей), действуем следующим образом:

1. Нейронные связи с низкой связностью
   1. Заполните патч-пипетки внутренним раствором состава, приведенного в таблице 1. Для всех регистраций в цельноклеточной конфигурации добавляйте биоцитин в концентрациях от 3 до 5 мг/мл во внутренний раствор (пипетку) для получения хороших результатов окрашивания пре- и постсинаптических нейронов. Дайте биоцитину диффундировать в клетку в течение не менее 15 - 30 минут (в зависимости от размера нейрона).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте биоцитин в раствор, используемый в «поисковых» пипетках, упомянутых ниже.
   2. Патч предполагаемого постсинаптического нейрона в режиме цельной клетки. Используйте патч-пипетки с длинным и тонким хвостовиком. Это облегчает маневренность пипетки под объективом и уменьшает артефакты движения, которые могут возникнуть при введении электрода в срез.
   3. Затем наведите патч на потенциальный пресинаптический нейрон в конфигурацию, прикрепленную к клетке, с помощью «поисковой» патч-пипетки с сопротивлением 8-10 МОм и небольшим диаметром кончика. Эти пипетки создают «свободный» пластырь, прикрепленный к клетке. Заполните «ищущую» пипетку внутренним раствором, в котором K⁺ заменен на Na⁺ (Таблица 2), чтобы предотвратить деполяризацию нейронов во время поиска пресинаптической клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сопротивление «рыхлому» уплотнению не находится в диапазоне GΩ, а обычно составляет около 30 - 300 МОм.
   4. Удерживайте потенциал мембраны под «свободным» уплотнением на уровне примерно от -30 до -60 мВ в режиме текущего зажима. Затем подайте большие импульсы тока (0,2 - 2 нА), чтобы вызвать потенциал действия в потенциальной пресинаптической клетке. Наблюдайте за этим потенциалом действия в виде небольшого колоска на характеристике напряжения.
   5. Установите частоту стимуляции на 0,1 Гц, чтобы предотвратить снижение постсинаптического ответа. Используйте более низкие частоты стимуляции, если мозговая ткань очень незрелая или синаптическая связь не очень надежна.
   6. В случае, если «постсинаптический» нейрон не реагирует на стимуляцию испытуемого «пресинаптического» нейрона, патчируйте новый нейрон в режиме «свободного» уплотнения. Не заменяйте «поисковый» патч-электрод до тех пор, пока установлено уплотнение с сопротивлением >30 МОм. Таким образом, можно протестировать до 30 потенциально пресинаптических нейронов.
      заметка: Чтобы предотвратить повреждение нейрона во время процедуры поиска с помощью ослабленного пластыря, к поисковой пипетке следует применять только мягкое отсасывание по сравнению с отсасыванием цельноклеточного патч-пипетки.
   7. Если стимуляция в режиме «свободного» уплотнения приводит к возникновению EPSP/IPSP (возбуждающий постсинаптический потенциал/тормозной постсинаптический потенциал) с латентностью <5 мсс в постсинаптическом нейроне, удалите «ищущую» пипетку из пресинаптического нейрона.
   8. Замените «поисковую» патч-пипетку на патч-электрод, заполненный биоцитинсодержащим обычным внутренним раствором. Убедитесь, что сопротивление этого записывающего патч-пипетки составляет 4–8 МОм; Чем больше размер SOMA, тем ниже может быть сопротивление электродов.
   9. Заплатите пресинаптический нейрон и запишите запись в режиме целой клетки, в режиме тока-зажима. Вызывайте потенциалы действия путем инжекции тока в пресинаптические нейроны и регистрируйте постсинаптический ответ. Сохраните данные на компьютере для последующего анализа в автономном режиме.

Таблица 1. Раствор пипетки с низким содержанием хлоридов.

	миллиметр	г/л	г/50 мл
К-глюконат	135	31.622	1.5811
KCl	4	0,298	0,0149
ХЕПЕС	10	2.384	0,1192
Фосфокреатин	10	2.552	0,1276
АТФ-Mg2+	4	2.028	0,1014
ГТП-НА	0,3	0,156	0,0078
Отрегулируйте pH до 7,3 с помощью KOH
Осмолярность ~300 мОсмол/л
Добавьте 3 - 5 мг/мл биоцитина

Таблица 2. Пипетка с высоким содержанием натрия для поиска синаптически связанных нейронов.

Сталь

	миллиметр	г/л	г/50 мл
Na-глюконат	105	22.92	1.146
NaCl	30	1.76	0,088
ХЕПЕС	10	2.384	0,1192
Фосфокреатин	10	2.552	0,1276
АТФ-Mg2+	4	2.028	0,1014
ГТП-НА	0,3	0,156	0,0078
Отрегулируйте pH до 7,3 с помощью NaOH
Осмолярность ~300 мОсмол/л

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
усилитель	ХЕКА	EPC 10 USB тройной	с 2-3 предусилителями
микроскоп	Олимп	BX51WI	с 2 портами камеры и объективом 4×, объективом погружения в воду 40×
фотоаппарат	ТИЛЛ Фотоника	ВХ55	инфракрасная ПЗС-камера
рабочая станция	Луигс и Нейман	Инфрапатч 240	с моторизованным x-y столиком и моторизованной осью фокусировки для микроскопа
микроманипулятор	Луигс и Нейман	СМ-5	X-Y-Z манипуляторы для 2-3 предусилителей
Клетка Фарадея	Луигс и Нейман
Антивибрационный стол	Ньюпорт Спектра-Физика
Патчмастер	ХЕКА
микротом	Микром Интернэшнл	ХМ650В
Съемник микропипеток	ХЕКА	Саттер-97
Система Neurolucida	Микробрайтфилд		с программами Neurolucida и Neuroexplorer